除了基因測序還能幹什麼？揭秘下一代測序在生物醫療領域的其他應用

目前的下一代基因測序（NGS）市場，Illumina繼續獨佔鰲頭。自從推出HiSeq X測序平台以來，大幅度降低了基因測序的成本，即使是研究級全基因組測序的成本一直穩定在1000美元左右。至此以後，這一水平的唯一競爭對手——華大基因的Revolocity測序儀也顯得吃力。這也引起了許多研究人員猜測，長此以往會導致這一領域缺乏競爭力，導致NGS的發展（至少在短鏈閱讀研究上）十分緩慢。但令人欣慰的是，NGS在其他領域的應用發展也十分迅速。

近日，Genetic Engineering & Biotechnology News對這些領域做了一次盤點，動脈網（微信：vcbeat）對主要內容進行了編譯。

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長鏈閱讀技術

NGS在長鏈閱讀領域有巨大的進展，揭示了基因組合轉錄的複雜性。在基因組的分析過程中，主要的問題是處理重複序列的DNA。如果序列重複的長度要長於基本閱讀的長度，那麼實現參考基因組的唯一映射就會變得很困難，甚至是不可能。

無獨有偶，基因轉錄的分析過程也面臨同樣的挑戰。「大多數基因包含了多個外顯子，以至於mRNA的長度比閱讀範圍的長度要長。」Personalized Healthcare 的Brenton Gravely博士表示：「因此，利用長鏈閱讀來準確無誤的了解特定樣品中存在哪一種異構體，是不太可能的。」

Oxford Nanopore是一家備受關注基因測序公司。去年春天，Oxford Nanopore率先推出了基於納米孔技術的測序儀MinION。儘管 後來Oxford Nanopore推遲了正式發布的時間，但公司已經確實將它的技術推廣到大眾。目前，超過1000家研究團隊使用是MinION測序儀。

在最初版本發布一年之內，通過對酶化學和納米孔設計的一系列改進，MinION的生產量從不足1億增長至超過10億。從質量，產量和成本來看，MinION與Illumina還存在一定差距，但 Oxford Nanopore 的儀器卻在兩方面佔有優勢：閱讀長度和可移動性。

在使用者的報告中反饋出，成千數萬次閱讀中的平均長度超過了10萬。DNA的輸入質量和預備存儲似乎是限制閱讀長度的唯一真正的因素。也就是說，如果滿足了輸入質量和預備存儲，就能夠延長閱讀長度。

同時，MinION還是一款可手持的測序儀，甚至可以在野外完成數據收集，不需要將處理後的樣品帶回實驗室再進行分析。一開始，數據質量遠遠低於Illumina，但經過改進，數據質量已經大幅提高。最新的R9 主打快捷模式，在理想環境下，測試的精度已經上升到95%。

太平洋生物是長鏈閱讀測序的領導者，近年也是成果頗豐。去年美國人類遺傳學會上，公司公布了一個新的平台---Sequel。這個平台是與羅氏合作開發的成果，相比之前的RS II，在各個方面都有提升。

與RS II相比，Sequel的輸出率更大，所佔空間不到之前2/3，成本也只需要之前的一半。一直以來，太平洋生物科學公司都希望平台能夠充分利用，解決化學和供應問題，特別是對可消費的SMRT（single molecule, real time）細胞。目前，這兩個問題似乎都得以解決，公司正在等待第一批客戶生成的數據反饋。

除了以上兩家，行業內有影響力的還有GemCode的10X Genomics，可以從底層短鏈閱讀數據生成連接。儘管這項技術還存在一些瑕疵，比如對於長於底層短鏈閱讀的重複片段作用不大。但目前平台運作良好，今年早些時候還與Illumina 簽訂了聯合營銷協議，如果 Illumina的Moleculo synthetic長鏈閱讀技術衰退，則協議開始生效。

儘管有所進步，但長鏈閱讀技術，特別是基因轉錄測序，仍有問題仍急需解決。「而其中一個問題就是目前這些平台的吞吐量，但更大的問題是，逆轉錄酶的間斷性還不夠。」Gravely博士解釋道：「在RNA直接測序中，性能優越的逆轉錄酶可以帶來很大的改變。」

令轉錄研究人員興奮的是，Oxford Nanopore在最近發表的一篇論文中表明，他們正著手推出利用MinION 直接測序RNA的商業試劑盒。

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單細胞基因組學

另一個應用就是單細胞基因組學。到目前為止，所有NGS項目（只有極少數例外）都是在混合細胞中進行的，即從上千乃至上萬個細胞中對單個細胞進行測序。如果所有的細胞都是完全均勻的，那麼所有細胞可作為一般情況下的體細胞基因組，這並不是一個問題。然而，許多應用程序中，並不是所有的細胞都是完全均勻的，需要集中彙集挑選關鍵信息。

例如，腫瘤活檢就極富異質性，包含了體細胞和癌細胞。不僅如此，即使是同一個腫瘤的癌細胞也可能有不同的基因組。匯聚多個細胞，就會產生一個混合的基因組庫，加大了解釋和分析的難度。目前的研究水平，只有小部分的細胞變化是可以忽略不計的。

一開始，研究人員採取的策略是嘗試在活檢組織內部的幾個不同的地方，分別採取幾個單細胞進行測量。如果積累了足夠多的個體測量，那麼就可以建立一個全面的腫瘤基因組視圖。

另一個方法就是單細胞途徑。轉錄組是高度可變的細胞，將細胞聚集起來可以掩蓋基因表達模式的潛在變異。

「就在幾年前，上百個單細胞的轉錄學分析可能花費大量的時間和資源。」基因組學科學家Richard Shen最近離開了Illumina跳槽到RS技術公司，他提到：「現在，隨著簡單易用的NGS文庫技術的發展，大大降低了開發成本，分析上千個單細胞不僅成為現實，而且所分析得到的數據在許多應用中也顯示了價值。」

對於單細胞庫的製備，許多平台都可以實現：Fluidigm的C1，可以同時處理800個細胞；Chromium的10X Genomics，更是可同時處理多達48000個細胞。這樣的處理能力，並不是每個研究人員的目的，Gravely 指出：「一些平台或者自製設備的吞吐量是非常讓人興奮的，我們所希望看到的是疊加效果，比如像holy grai這樣的單細胞長鏈閱讀測序儀。」

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癌症液體活檢

同樣吸引人注意應用就是癌症診斷的液體活檢。某種程度上，NGS在腫瘤活檢領域的應用在正越來越普及。Foundation醫學的FoundationOne測試就是最好的例子。一個由315種相關癌症基因的標記組合成的單一測試面板。這些基本面板測試取代了傳統的單一基因測試。

癌症診斷也在從腫瘤組織活檢向液體活檢偏移。不同於從腫瘤上切片提取DNA，癌症液體活檢從循環腫瘤細胞（CTCs）或者患者血液中游離細胞中提取游離DNA（cfDNA）。就目前來看，由於提供了許多解刨和細胞結構的信息，腫瘤組織活檢暫時不會消失，但是許多液體活檢的研究人員表示，液體活檢具有更多功能性。

「從癌症篩查的角度來看，液體活檢更具有吸引力，因為他們不但更簡單準確，而且可以進行癌症之前的常規檢查。」Freenome聯合創始人兼首席執行官 Gabriel Otte表示：「從預防和確診病人的檢測來看，液體活檢同樣具有優勢，尤其是那些超過30%因為各種原因不適合侵入性活檢的病例。」

作為一個熱門的新領域，一些新興企業正迅速成長，更多的大公司正在革新以佔取龐大且不斷增長的市場。

早在2014年，Guardant Health聲稱他們是第一個走向市場的液體活檢企業。這一診斷被稱為Guardant360。Freenome採取了不同的手段，通過測試癌症全基因組來實現癌症診斷。「我們依靠我們的深度學習。」Otte表示：「為了做出準確的癌症檢測，我們根據最相關的特定區域對做出了特定的分區。」

Illumina的測序技術已經被大多數公司利用，在這場競技中，也推出自己的液體活檢公司---Grail。也許是為了避免與自己的客戶出現直接競爭，Illumina表示將主要圍繞前期篩選，這個沒有其他公司關注，且更具挑戰性的任務。

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縱向研究

隨著液體活檢的出現，監測研究性試驗中腫瘤患者的反映，以及適當的樣品跟蹤已經變得越來越重要。這一過程，至少需要分析3種樣品：腫瘤組織，正常組織和循環遊離DNA。

當測序在的目標較大，比如對全基因組進行排序時，遺傳指紋是可以被確定的，以至於在數據分析過程中樣本可以進行適當的匹配。然而，Swift Biosciences生物學家Drew McUsic博士表示，當測序目標較小時，遺傳指紋不能產生。

「直到現在，研究人員仍利用單核苷酸的多樣性與LIMS系統排列配對來正確跟蹤樣本。」McUsic博士指出：「這些方法依賴於對多個樣本的正確標記，以及數據文件與材料的精確匹配。」

為了尋找更精確的樣本識別方法，Swift生物科技開發了一款Accel-Amplicon Sample_ID 面板。遺傳指紋由104個外顯子和性別特異性擴增子提供，作為低比例spike-in（待測樣品中加入標準樣，以檢測你在實驗操作過程中的樣品損失），添加到任意一個Swift增擴平台，例如 Accel-Amplicon 56G Oncology Panel v2。McUsic博士還補充到：「從淺顯的生殖測序到到深度覆蓋性體細胞突變檢測都可以使用這樣的技術。」

該技術不僅提供了一個有效的，單管檢測分析腫瘤標本的體細胞突變，同時在相同的測序文件內產生基因指紋。他繼續說道，隨著越來越多的項目被設計應用到跟蹤腫瘤患者的反應率，在這些縱向研究將選擇合適的標本跟蹤工具將顯得越來越重要。

目前來看，Illumina將繼續佔有市場主導地位以及短鏈閱讀的高通量，但其他公司也在其他領域尋求進步。Oxford Nanopore宣布了許多即將展開的研究，包括高通量的納米孔測序儀PromethION。該公司聲稱，他的吞吐量將能夠與Illumina的 HiSeq X競爭。公司還就 兩台自動化樣品儀器VolTRAX和 Zumbador展開討論，保證未來DNA測序的全方位簡化。

太平洋生物的 Sequel 平台也有望被迅速採用。它可能帶來測序成本的降低，升值可能趕超Illumina。可以肯定的是，隨著使用的簡化和成本的減少，NGS臨床使用的障礙將得到改善。

文|周夢亞

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