CRISPR 的競爭者太多，不止有 NgAgo

CRISPR 系統並不完美，科學家從未停止尋找其他基因編輯工具的腳步。

撰文 Heidi Ledford

翻譯 趙琳

審校 趙維傑

CRISPR-Cas9的潛在競爭者之一：Argonaute。圖片來源:SPL

利用 CRISPR-Cas9 技術，科學家們已經可以隨心所欲地對基因組進行編輯。和之前的技術相比，它簡單、廉價、用途廣泛。全世界從事醫學與基礎科學研究的實驗室都對它充滿興趣，不斷拓展它的應用。

然而，儘管如此，CRISPR-Cas9 並不完美。加利福尼亞大學聖迭戈分校的生物工程學家 Prashant Mali 認為，「這個系統尋找基因組中指定位置並對其進行精確切割的能力十分出色，「但有時，我們需要的不止這些。」

CRISPR-Cas9 系統的局限性推動著尋找其替代者的工作。今年年初，研究者將目光投向了另一個可能也可以執行基因編輯的系統，NgAgo。哈佛醫學院的遺傳學家 George Church 表示：新技術都是脆弱的，隨時可能被取代。

然而，NgAgo 並不是唯一一種新型的基因編輯工具。這些新工具中，有些改良自 CRISPR 系統；另一些則提供了全新的模式。

1迷你版 Cas9

金黃色葡萄球菌中的一種小型 Cas9 蛋白可以用於 CRISPR 系統，完成基因編輯。圖片來源:SPL

在將來，CRISPR-Cas9 系統可能會用於基因療法，改寫遺傳疾病的相關基因。基因療法通常使用病毒作為載體，將外源遺傳物質運載進入人體細胞。而病毒基因組容量有限，很難容納 CRISPR-Cas9 系統的全部組分——Cas9 酶，以及引導用的單鏈 RNA。

一種迷你型 Cas9 酶的發現有可能解決這一問題【1】。這個迷你版來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），它的序列足夠短，可以壓縮進當前用於基因療法的病毒中。去年12月，兩個研究組利用迷你版 Cas9 修正了小鼠體內的杜興氏肌營養不良症（Duchenne muscular dystrophy）的相關基因【2,3】。

2Cas9 的姐妹們

合成生物學家張鋒，他的團隊不僅在 CRISPR-Cas9 系統的應用領域做出了傑出貢獻，也發現了 Cas9 的姐妹：Cpf1。圖片來源：Justin Knight Photography

Cas9 並不能切割所有的序列，只有當靶向序列附近存在一段特定的 DNA 序列時，這段序列才能被特異性地切割。這個要求在大部分基因組中都能滿足，但對某些實驗來說卻構成阻礙。研究者們希望能夠在微生物中找到 Cas9 的姐妹，在切割過程中它們所需的附近序列與 Cas9 不同，這將可以拓展 CRISPR 系統的應用範圍。

Cpf1 就是這樣一種酶。它比 Cas9 小，所需要的靶向序列附近的特定 DNA 序列與 Cas9 不同並且高度特異【4,5】。

Cas9 的另一個姐妹 C2c2 則可以切割 RNA 而非 DNA，這一特性可以用於 RNA 相關領域的研究，或者用來抵禦 RNA 病毒【6】。

3真正的基因編輯，不只是敲除

在Cas9基礎上改造得到的蛋白具有定點突變功能。圖片來源：David R. Liu 實驗室網站

在許多實驗室里，CRISPR-Cas9 只用來做基因敲除。Church 說：「人們想宣告說這就是基因編輯，然而燒掉書中的某一頁並不等於是在編輯這本書。」

比基因敲除更難的，是將一段序列替換為另一段序列。Cas9 切割 DNA 後，細胞中的修復機制常常會錯誤地將打斷的末端連在一起，從而實現基因敲除。

想要改寫 DNA 序列的研究者，則希望另外一種修復機制發生，將一段新的 DNA 序列插入到基因組中，然而這種機制發揮作用的幾率遠小於直接連接。明尼蘇達大學的植物科學家 Daniel Voytas 說：「所有人都說，在未來我們將可以一次性編輯多個基因。但我認為，我們現在甚至還不能高效地完成『一次真正的基因編輯』。」

然而，過去幾個月中的進展為 Voytas 帶來了希望。今年4月有研究者宣布，他們將失活的 Cas9 與一個可以製造 DNA 點突變的酶連接在了一起。失活的 Cas9 仍然可以定位於引導RNA 所指定的序列，但無法完成切割。而此時，與之相連的酶可以製造點突變，將 C 突變為 T 【7】今年8月發表於 Science 雜誌的另一篇論文也報道了類似的結果【8】。

Voytas 等人對類似的嘗試表示了期待，將失活 Cas9 與不同的酶相連接，可能會完成更豐富多變的序列改變。

4進擊的 Argonautes

NgAgo 系統的發明者韓春雨。圖片來源：河北科技大學官網

今年五月，發表在 Nature Biotechnology 上的一篇論文【9】報道了一個全新的基因編輯系統。研究者聲稱能夠使用 NgAgo 蛋白在指定位點上切割 DNA ，這個過程使用與目標序列互補的短鏈 DNA，而非 RNA 作為引導，並且不要求切割位點附近存在某種特異性的序列。

這個發現掀起了一股熱潮，不少人認為 CRISPR-Cas9 將會被取代。但目前為止，其他實驗室都未能重現該結果。首爾基礎科學研究所的基因工程學家 Jin-Soo Kim 認為，即便如此，人們還沒有放棄希望，來源於其他細菌的 Argonautes 家族蛋白（NgAgo 是 Argonautes 蛋白家族的成員）有可能會提供新的思路。

5更多可能

其他的基因編輯系統也正在建設中，然而它們中的一部分在過去多年中都進展緩慢。在一個致力於在細菌中進行基因編輯的大規模項目中，Church 的研究組並沒有選擇 CRISPR 系統。他們主要使用的是一個名為「lambda Red」的系統，經過編碼，它可以用來編輯特定的 DNA 序列，而這個過程不需要引導 RNA 的存在。Church 的研究組已經在 lambda Red 系統的研究上花費了13年的時間，但是這個系統依舊只能在細菌中發揮作用。

Church 與博德研究所的生物工程學家張鋒都提到，他們的實驗室正在研究可以用於基因編輯的整合酶（integrases）與重組酶（recombinases）。張鋒說：「通過對多種酶進行探索，我們可以得到一個更強的基因組編輯工具箱。我們必須繼續探索未知。」

參考文獻：

1. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. F. A. Ran et al. Nature 520, 186-191 (2015).

2. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Nelson, C. E. et al. Science 351, 403–407 (2016).

3. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Tabebordbar, M. et al. Science 351, 407–411 (2016).

4. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Kim, D. et al. Nature Biotechnol. (2016).

5. Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells. Kleinstiver, B. P. et al. Nature Biotechnol. (2016).

6. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Abudayyeh, O. O. et al. Science 353, aaf5573 (2016).

7. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Nature 533, 420–424 (2016).

8. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems . Nishida, K. et al. Science (2016).

9. DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute. Gao, F. et al. Nature Biotechnol. 34, 768–773 (2016).

文章來源：Nature 536, 136–137 (11 August 2016) doi:10.1038/536136b

http://www.nature.com/news/beyond-crispr-a-guide-to-the-many-other-ways-to-edit-a-genome-1.20388#/references

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