中國科學家發現NgAgo系統有效，但只發現基因功能敲低未出現基因編輯效應

圖片摘自原文

2016年11月14日 訊 /生物谷BIOON/ --最近，由中國科學院主辦的英文期刊Cell Research（細胞研究）在線發表了復旦大學和南通大學聯合研究的一篇題為「NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish」（基於NgAgo技術對fabp11a基因敲減可引起斑馬魚眼睛發育缺陷）的 「致編輯信」文章。

文章中，研究者介紹，在使用NgAgo之後，雖然發現了NgAgo的其它特性，但並沒有發現任何基因編輯的現象。研究者利用NgAgo技術在斑馬魚的細胞中進行研究後發現，斑馬魚的眼睛發育出現了缺陷，隨後通過測序後他們發現，從基因組層面上來講，使用NgAgo技術並未對斑馬魚產生任何基因編輯的效應，僅僅只是mRNA的表達量上發生了改變。

這項研究中，研究者並非利用哺乳動物進行研究，而是利用模式動物斑馬魚進行了相關研究，斑馬魚是一種具有多種優勢的模式生物，其能夠幫助科學家們進行遺傳學、發育生物學、血管生物學及疾病模型等領域的研究；在過去很多年裡，諸如鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs ）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）、以及CRISPR/Cas9都已經在斑馬魚中進行了研究，而近來一種名為gDNA/NgAgo的新系統也因其脫靶率較低易操作等獨特的優勢讓很多科學家眼前一亮，這項研究中，來自復旦大學和南通大學的研究人員就通過研究調查了是否gDNA/NgAgo系統能夠用來操控斑馬魚機體的基因，隨後研究者就以fabp11a基因作為研究對象進行深入研究。

脂肪酸結合蛋白11a（fabp11a）是細胞內FABPs結合蛋白家族成員之一，該蛋白家族在調節機體葡萄糖和脂質動態平衡及炎症上扮演著重要作用，截至目前為止，研究者並不清楚基因fabp11a在斑馬魚發育過程中的具體功能，為了調查是否5』-磷酸化單鏈DNA能夠指導NgAgo來干擾斑馬魚機體內源性基因的表達，研究者構建了氨基端和羧基端分別攜帶核定位信號肽的NgAgo分子（NgAgo-2nls）來用作對斑馬魚進行深入研究，研究者發現，兩個具有24bp長的5』-磷酸化單鏈DNA寡核苷酸（FW-guide 1和FW-guide 2）能夠靶向作用fabp11a基因的第二個和第三個外顯子，而且每一個寡核苷酸都能夠同NgAgo-2nls的mRNA共同注入到斑馬魚的胚胎細胞中，更有意思的是，研究者還發現，大約30%被注入的斑馬魚胚胎都會表現出嚴重的眼部表型，要麼一隻眼睛小一隻眼睛正常（第一種類型）；要麼頭頂長出一隻較大面積融合性的眼睛（第二種類型）。

為了調查是否斑馬魚眼睛缺陷的發生是由fabp11a基因的遺傳突變引起的，研究者從異常眼部表型的斑馬魚胚胎中進行全基因組DNA的提取，並且利用PCR的方法對靶向區域序列進行擴增，研究者發現，異常的斑馬魚胚胎機體中fabp11a基因的表達水平降低了，而且gDNA/NgAgo系統引發的斑馬魚胚胎異常表現或許能夠通過外源性添加fabp11a的mRNA來恢復。

研究者為了證實gDNA/NgAgo系統的確能夠作為一種基本原則來敲除斑馬魚機體中的基因，研究者利用該系統檢測了斑馬魚機體中另外一種名為ta的基因，該基因能夠編碼斑馬魚胚胎中胚層形成所需的T-盒轉錄因子；隨後研究人員對斑馬魚機體中kdrl，lama1以及flt1基因都進行了檢測，結果表明gDNA/NgAgo系統能夠明顯降低這些基因的表達並且誘發與斑馬魚出現眼睛發育缺陷結果相似的一些表型。

這項研究中，研究者通過研究發現，利用gDNA/NgAgo系統進行的基因敲減能夠影響斑馬魚機體中基因的功能表達，此外研究者在斑馬魚所有胚胎中並未檢測到任何基因突變，為此研究者假設，gDNA/NgAgo或許能夠同靶向基因結合來阻斷基因的轉錄，總而言之，研究者認為gDNA/NgAgo系統或許能夠提供另外一種特殊的系統來對斑馬魚進行基因敲減研究。

最後研究者指出，此前韓春雨的研究論文是在哺乳動物（人）的細胞中進行的相關研究，而這篇研究中我們是在斑馬魚中進行的研究，二者屬於兩個不同的系統，而且在做法上也存在一定的差別，在使用NgAgo技術之後，雖然我們發現了NgAgo的其它特性，但並未發現任何基因編輯的現象。當研究人員在斑馬魚的細胞中使用NgAgo技術後發現，斑馬魚的眼睛發育出現了缺陷，當然這疑似發生了基因編輯現象。但是通過後期測序後他們發現，這從基因組層面上來講沒有出現任何基因編輯的現象，只是mRNA表達量上發生了改變，這或許就說明，引起斑馬魚胚胎髮育缺陷的原因是基因敲減，而並不是基因編輯。（生物谷Bioon.com）

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doi:10.1038/cr.2016.134

PMC:

PMID:

NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish

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