20位科學家發文再質疑NgAgo實驗結果
11月15日，20位科學家在學術期刊《蛋白質與細胞》（Protein & Cell）以來信（Letter）形式在線發表文章「關於NgAgo的疑問（Questions about NgAgo）」
撰文 | 陳曉雪
責編 | 李曉明
備受關注的NgAgo可重複性爭議日前有了新進展。
11月15日，學術期刊《蛋白質與細胞》（Protein & Cell）以來信（Letter）形式在線發表了一篇題為「關於NgAgo的疑問（Questions about NgAgo）」的文章，由國內外20家實驗室的負責人聯合署名，對河北科技大學副教授韓春雨等人發表在《自然-生物技術》（Nature Biotechnology）的論文結果提出質疑，表示無法重複韓春雨的NgAgo實驗結果。
這20位作者名單中，有17位是國內學者，其中包括10月10晚實名發聲「未能重複韓春雨實驗」並呼籲第三方介入調查的11位科學家（谷峰、黃志偉、李勁松、王皓毅、李偉、孫育傑、魏文勝、吳強、王曉群、熊敬維、楊輝），另有三位科學家在國外機構任職，包括美國國立衛生研究院人類基因組研究所資深研究員Shawn Burgess、美國約翰霍普金斯大學醫學院教授程臨釗以及美國加州大學洛杉磯分校教授林碩。
《蛋白質與細胞》（Protein & Cell）由高等教育出版社、北京生命科學院和中國生物物理學會2010年聯合創辦，清華大學教授、中科院院士饒子和擔任主編。
20位科學家稱實驗無法重複，
已排除細胞污染
20位科學家針對韓春雨NgAgo論文圖4結果的重複實驗顯示，未能在靶向位點檢測到Indels。來源：Burgess, S., Cheng, L., Gu, F. et al.Protein Cell(2016).
《自然-生物技術》刊發韓春雨NgAgo實驗結果顯示，DNA介導的基因編輯工具NgAgo可以在哺乳動物基因組的47個位點實現100%的基因編輯，效率為21.3%-41.3%。來源：Gao, Feng, et al.Nature Biotechnology(2016).
今年5月12日，韓春雨團隊在《自然-生物技術》發表的文章顯示，DNA介導的基因編輯工具NgAgo可以在哺乳動物基因組的47個位點實現100%的基因編輯，效率為21.3%-41.3%。
在《蛋白質與細胞》發表的這篇來函文章中，署名的20位作者指出，他們在不同的細胞系以及小鼠、斑馬魚等系統中對NgAgo的基因編輯活性進行了測試，但沒有一個實驗發現NgAgo能夠實現韓春雨論文中所稱的基因組DNA的編輯。之後，一些作者轉而使用韓春雨使用的或提供的質粒進行重複實驗，「再一次，內源基因組DNA的編輯沒有成功」。
作者們對韓春雨論文中的圖4結果也進行了獨立重複實驗，在293T細胞中選擇了韓春雨論文報告的相同基因進行測試。「幾個不同實驗室的研究者獨立完成了他們的實驗，但在靶向位點沒有觀察到任何Indels。」文章寫道。Indel是分子生物學中的一個術語，是「insertion」（插入）和「deletion」（缺失）兩個單詞的縮寫，指的是在DNA中的核苷酸插入或缺失。因為NgAgo實現編輯基因的結果為插入或缺失Indel，無法觀察到Indel就被認為不符合預期結果。
文章的補充材料中還包括署名作者們在不同系統中嘗試NgAgo的結果，「這些研究沒有一個證明NgAgo有基因組編輯的活性」。
此前，韓春雨曾多次在接受媒體採訪時稱，重複不出來的實驗室可能存在「細胞污染」等問題。作者們表示，不可能所有的獨立實驗室都出現細胞污染，「事實上，多位署名作者的實驗室在做重複實驗之前，都會首先檢測細胞，確保它們不受支原體的污染。」
韓春雨原始論文中圖3C的結果示意圖，上圖顯示了為NgAgo設計的的ssDNA以及為Cas9設計的sgRNA在它們的目標質粒pEGFP-N1上的位置。下圖顯示了在western雜交實驗中HELA細胞中目標質粒pEGFP-N1的產物eGFP的表達水平，還標註了這些實驗中針對該質粒的NgAgo和對應的ssDNA或者Cas9和對應的sgRNA。最下方的圖顯示了eGFP和內參基因actin條帶的灰度比值。來源：Gao, Feng, et al ，Nature biotechnology(2016)
文章還指出，他們在重複韓春雨論文中圖3c的結果時，確實在轉染NgAgo和靶向GFP（綠色熒光蛋白）後看到GFP表達下降，但是並無法通過測序證實這是DNA突變的結果。「很多因素都可以影響到GFP的表達，比如NgAgo靶向DNA的能力，以及轉染造成的非特異性應激（non-specific stress）等。」作者們在文章中解釋說。
此外，韓春雨曾在多次報告中稱NgAgo實驗需要「高超的實驗技巧」，但20位作者的質疑文章反駁了這一說法——「無論是論文最初刊發的實驗流程還是在Addgene網站發布的最新信息，這些步驟似乎都不需要『高超的實驗技巧』。」部分作者甚至派學生到韓春雨的實驗室拜訪學習，但在此期間，他們都未獲允許操作哺乳動物基因組編輯的實驗。其結果就是，沒有一個學生得到證實韓春雨數據的信息。
在文章最後，作者們表示，希望原始論文的作者們能夠澄清有關NgAgo的疑點，提供所有的實驗細節以重複其最初的結果。
據文章的通訊作者之一、北京大學生命科學學院研究員魏文勝介紹，他們曾在10月中旬將這篇文章投給最初發表NgAgo論文的《自然-生物技術》，但《自然-生物技術》在此之前已收到一篇類似的文章，20位科學家遂轉投《蛋白質與細胞》，文章得以快速評審並發表。
韓春雨最新回應：
再次重複成功
此前，韓春雨曾向《知識分子》表示，科學的問題要通過科學的方法去解決，「第二篇文章（關於NgAgo的文章）出來之前，這種質疑聲音始終都會在的，不可能通過幾次報道，就解決問題的。」 學術期刊《細胞研究》（Cell Research）常務副主編李黨生博士也曾向《知識分子》表示，科學上的爭議的最終解決只能靠科學共同體的進一步驗證。
面對《蛋白質與細胞》在線發表的針對NgAgo可重複爭議的文章，韓春雨在11月16日下午回應《知識分子》稱，（質疑）文章的具體內容他還沒有看，但他的實驗室已經再次重複實驗並成功，只是「細胞需要處理才能做」。然而，韓春雨拒絕透露處理細胞的詳情，稱「這個處理還沒有完善，如果要發文章，做出回應（correspondence），還需要把這個東西進一步明確」。
韓春雨說，他還找了兩家實驗室，按照他確定的方法能做出來。但是他不願意透露這兩個實驗室的名字。
懸疑：
「誰來調查這件事情？」
在學術期刊上發表針對已有研究工作的質疑是解決學術爭議的重要一步，但是有關韓春雨實驗是否可以重複，當前出現了尖銳對立的兩種觀點一直無法得到澄清。「如果不能重複，這究竟是一種誠實的錯誤，還是一種學術不端行為，現在依然不清楚」，中科院科技政策研究所研究員李真真對《知識分子》表示，「誰來調查這件事情？這麼巨大爭議的問題現在沒人管，說明我們國家的科學共同體應對此類問題還很不成熟。」
20位署名作者名單
Shawn Burgess，美國國立衛生研究院人類基因組研究所資深研究員；
程臨釗，約翰霍普金斯大學醫學院教授；
谷峰，溫州醫科大學眼視光學院研究員；
黃軍就，中山大學生命科學學院教授；
黃志偉，哈爾濱工業大學生命科學與技術學院教授；
林碩，加州大學洛杉磯分校分子、細胞與發育生物學系教授；
李勁松，中科院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所研究員；
李偉，中科院北京動物所研究員；
秦偉，北京大學深圳研究院教授；
孫育傑，北京大學生物動態光學成像中心研究員；
松陽洲，中山大學生命科學學院教授；
魏文勝，北京大學生命科學學院、生物動態光學成像中心研究員；
吳強，上海交通大學系統生物醫學研究院教授；
王皓毅，中科院北京動物研究所研究員；
王曉群，中科院生物物理研究所研究員；
熊敬維，北京大學分子醫學研究所研究員；
席建忠，北京大學工學院研究員；
楊輝，中科院上海神經生物學研究所研究員；
周斌，中科院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所研究員；
張博，北京大學生命科學學院教授。
致謝：王承志對本文亦有貢獻。
參考文獻：
2.Gao, Feng, et al. "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute."Nature Biotechnology(2016).
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