陳玲玲課題組發現新型lncRNA
10月27日，知名雜誌MolecularCell在線發表了陳玲玲課題組的一項重要研究成果，報道發現了一種新型的RNA轉錄加工產物：SPA及其分子機制。SPA是一種新型的lncRNA，它的5』端為snoRNA，3』端為Poly(A)(Huang Wu et al. 2016)。文中系統分析了SPA形成機制，分子細胞生物學作用機制並探討了PWS病人中SPA如何發揮作用的。
備註：
1.常規mRNA前體加工過程：
常規的真核生物mRNA加工過程包含三個步驟：5』加帽，外顯子拼接和3』加Poly(A)。其中3』加Poly(A)過程在Pol-II轉錄到終止子序列時，CPSFs識別AAUAAA短序列（個別情況下序列可能略有差別），下游還通常會有富含G/U的序列原件協助，對mRNA前體產物進行切割和加Poly(A)(Mandel et al., 2006)，後面剩餘的RNA轉錄產物由於存在5』磷酸基團而十分不穩定，可被核酸外切酶XRN2等識別並降解掉。
2.什麼是snoRNA？
snoRNA是存在於核仁或Cajal bodies的一類重要的RNA分子，與細胞核小RNA（snRNA）和核糖體RNA（rRNA）的加工修飾過程有關。大部分snoRNA是由基因內含子區編碼的，往往一個snoRNA對應於一個內含子。snoRNA分為兩大類：Box C/D snoRNAs和Box H/ACA snoRNAs。Box C/D snoRNAs包含四個蛋白：Fibrillarin (Fib)、Nop56、Nop58和15.5k。當一個內含子包含了兩個snoRNA基因序列的時候就可能會形成Sno-lncRNAs，這類lncRNA沒有5』加帽和3』加Poly(A)(Yin et al., 2012)。在人類胚胎幹細胞中，最主要的形成Sno-lncRNAs的基因區域在PWS病人中存在缺失性突變。
3.什麼是Prader-Willi syndrome（PWS）？
PWS是一類遺傳性神經發育異常疾病，臨床表現為神經系統發育異常、激素分泌失衡、肥胖、智力低下等。遺傳關聯定位分析表明PWS相關的突變為SNURF-SNRPN基因的3』UTR區的一小段基因缺失突變，基因座區位於15q11-q13。這一缺失突變導致PWS病人出現snoRNA和lncRNA表達異常。
SPA是如何發現的？
由於PWS病人缺失的區域有大量的snoRNA基因編碼，自然會想到如果用snoRNA相關的蛋白進行RIP實驗就可能會發現PWS相關的lncRNA。作者正是基於這一想法開展本項工作的。作者用抗Fib的抗體進行RIP實驗，所收集到的RNA產物進行二代測序（Fib-RIP-seq），從這一實驗的產物中，作者意外的發現了兩個SPA產物：包含5』端snoRNA和3』端Poly(A)的一種新型的lncRNA！作者分別將其命名為SPA1和SPA2。SPA1的5』端為SNORD107，有7個外顯子，長度約34000nt。作者接下來分別用Northern實驗，RIP-QPCR實驗，反義核苷酸干擾實驗，m7G帽子結構的抗體鑒定及Poly(A)（+）組分分離等實驗體系鑒定了所發現的兩個SPA分子的主要特徵。
圖1 SPA發現與鑒定實驗（來自(Huang Wu et al. 2016)）
(A) Fib-RIP-seq發現了SPA1和SPA2，兩種特殊lncRNA的定位示意圖。
(B) SPA1的序列特徵。
(C) Northern實驗，所設計的探針C雜出了SPA1，分子量約34000nt。
(D) 雙硫代磷酸修飾的反義寡脫氧核苷酸（ASO）可明顯降低SPA1的含量。
(E) Fib-RIP中QPCR驗證SPA1/2的確與Fib相互作用。
(F) m7G帽子結構的抗體不能結合SPA1/2。
(G) SPA1/2存在於Poly(A)（+）組分中。
SPA是如何形成的？
常規的聚合酶II轉錄產物往往帶有5』帽子結構，從上面的實驗中，作者卻發現SPA1/2不帶有5』帽子結構！於是作者就想知道SPA分子是如何形成的。作者在不表達SNURF-SNRPN基因和SPA的Hela細胞中通過設計構建載體進行了SPA形成機制的研究。作者基於SPA形成區域的基因結構特徵，設計了一系列的載體進行SPA形成相關基因序列的排查分析。所設計的載體包含了SNURF-SNRPN基因後側的外顯子（9和10，E9/E10），隨後的Poly(A)信號元件，SNURF-SNRPN與SPA基因間序列3.4Kb，其中包含了SNORD107（SPA1的5』端結構），後面是Poly(A)信號元件。作者推測從這一載體上可以產生一個5000nt的RNA前體產物以及500nt的前端產物（e9+e10，模擬前端的SNURF-SNRPN基因mRNA產物）和800nt的後端產物（SPA1，模擬內源性SPA1）。Northern實驗證實了這一推測，也證明所設計的載體符合預期。在這一載體的基礎上，刪除SNORD107 或者它的box C，box C』/D motifs（對應於圖中2-5泳道）均能明顯的影響SPA1的形成，對e9+e10沒有影響。而如果將SNORD107更換為另一種box C/D類的snoRNA：SNORD116-13或者box H/ACA類的snoRNA：SNORA5C均不影響SPA1的形成。這些說明5』的snoRNA對於SPA1的形成非常重要。
圖2 snoRNA對於SPA的形成至關重要
（來自(Huang Wu et al. 2016)）
由於SPA1和上游的SNURF-SNRPN基因為同一啟動子啟動轉錄的，因此作者推測SNURF-SNRPN基因的Poly(A)加工信號勢必對SPA1的形成有調控作用。因此作者設計了一系列的SNURF-SNRPN基因的Poly(A)加工信號突變體，包括刪除AAUAAA信號（泳道2），XRN2切割信號（泳道3），或者兩者一起刪除（泳道4），這些突變設計軍嚴重影響上游e9+e10的加工成熟，SPA1的生成方面，越多的RNA加工前體越容易形成更多的SPA1產物。而如果將中間的3.4Kb的間隔序列完全刪除（泳道5），e9+e10無法形成正確的產物，SPA1的形成也受到了抑制。而如果將上游的Poly(A)加工信號更換為效率更強的BGH基因Poly(A)加工信號（泳道6），上游的e9+e10形成左右明顯加強，但SPA1卻完全無法形成了。這些結果說明SPA1的形成需要上游基因相對弱的Poly(A)加工信號。
圖3 上游基因的Poly(A)加工信號對SPA形成的影響
（來自(Huang Wu et al. 2016)）
Poly(A)加工過程包含了在加工信號的特定位點將轉錄產物切開的過程，切開後前面的產物被繼續加Poly(A)，後面剩餘的產物由於帶有5』磷酸基團，會被CPSF73、CPSF30以及XRN2等外切核酸酶降解掉。在SPA1形成的過程中，SPA1與上游基因是同一轉錄產物上的，是何種機制導致SPA1形成而不是被降解掉是接下來需要解釋的問題。作者在PA1細胞中對CPSF73和CPSF30基因進行了Knock-Down實驗，結果表明干擾CPSF73和CPSF30會導致SPA1前體分子的聚集，XRN2的實驗結果也與此相似。這說明SPA1的形成過程還是需要這些核酸外切酶的作用的。這裡就出現了一個矛盾的問題：這些外切核酸酶是如何隻影響SPA1前體的加工，而不會直接降解掉SPA1的？在這一情形下為何RNA聚合酶II沒有終止轉錄作用？
作者檢測了這一區域RNA聚合酶II的轉錄速度，發現這一區域的轉錄速度（3.4Kb/min）明顯高於平均速度（2.5Kb/min），因此在這一區域，RNA聚合酶會在XRN2徹底消化RNA之前到達snoRNA的區域，snoRNA可以阻止XRN2的降解活動。作者通過在PA1細胞中表達不同突變形式的Pol-II突變體驗證了這一假設。
圖4 SPA1形成機制模型（來自(Huang Wu et al. 2016)）
SPA在細胞內如何發揮作用的？
作者首先分析了SPA1/2在人的胚胎幹細胞細胞系H9中的表達情況，證明它們是丰度較高的lncRNA，同時之前文獻報道的sno-lncRNA的含量也很高(Yin et al., 2012)。作者在H9細胞中進行了FISH原位雜交研究，證明SPA1/2和sno-lncRNA均定位於細胞核內。
圖5 SPA1/2定位於細胞核中（來自(Huang Wu et al. 2016)）
由於目前所構建的小鼠模型均沒有完全模擬出人類的疾病特徵，作者選擇利用CRISPR-Cas9技術進行基因打靶構建細胞模型。經過篩選，作者獲得了單條染色體敲除了141Kb的克隆株（H9 P-KO）。這一敲除株依然可以維持多能性，核型穩定，也可以分化為三種胚層的細胞類型，細胞整體的表達譜與H9幾乎沒有差別。作者構建1-2Kb的生物素標記的正義和反義探針序列，對SPA進行RNA Pull-Down分析，釣取到了三個相互作用蛋白：TDP43, RBFOX2和hnRNP M。進一步的RNA Pull-Down分析證明SPA2 及 sno-lncRNAs都與TDP43, RBFOX2和hnRNP M有相互作用。作者也用超高解析度光學顯微鏡分析了這些蛋白與RNA的空間定位。
圖6 PWS區域有多種相互作用蛋白
（來自(Huang Wu et al. 2016)）
接下來，作者用UV交聯後免疫沉澱（iCLIP）實驗分析了TDP43, RBFOX2和hnRNP M與RNA相互作用的位點，結果表明與相關研究的結論一致，TDP43結合UG-rich 序列，RBFOX2結合UGCAU 和 GCAUG 序列，hnRNPM 結合成簇的GU-rich 序列（常含有UU motif），進一步藉助超高解析度顯微鏡表明SPA和sno-lncRNAs對三種蛋白的結合作用略有不同，有一定的偏好性。
圖7 iCLIP實驗分析相互作用motif
（來自(Huang Wu et al. 2016)）
在作者所構建的PWS區域敲除株H9 P-KO中，作者分析了其中的RNA選擇性剪接的情況，結果表明敲除了PWS區域後RNA選擇性剪接的情況有非常明顯的變化，在WT和P-KOP的H9中，共鑒定到348種發生改變的RNA可變剪接作用，很多對應於TDP43 或RBFOX2，而對應於hnRNP M的卻很少。這些可變剪接在正常的hES中也存在。這表明SPA和sno-lncRNAs通過影響相互作用蛋白的定位而影響細胞內RNA加工過程。這或許為最終揭示PWS綜合症提供了重要的線索。
圖8 缺失PWS的hES細胞中RNA加工及RBP結合mRNA前體的狀態異常（來自(Huang Wu et al. 2016)）
總之，本文的工作非常嚴謹，為大家提供了非常棒的學習資料。本文從RIP實驗入手發現了奇怪的RNA分子：SPA，接著分別探索了SPA的形成機制和細胞定位，也做了敲除實驗，系統分析其分子作用機制。藉助RNA Pull-down實驗篩選到了SPA相互作用的蛋白分子，並結合敲除體系，最終揭示了完整的故事。由此不難看出，篩選鑒定相互作用分子的技術體系在RNA研究中具有特別重要的價值！將RIP和RNA Pull-down以及iCLIP等RNA相互作用分析技術靈活運用是RNA研究的重要工具，非常值得大家學習借鑒。此外，在環狀RNA加工的過程中是否也存在類似SPA的轉錄調控機制也值得思考。
參考文獻：
Huang Wu, Qing-Fei Yin, Zheng Luo, Run-Wen Yao, Chuan-Chuan Zheng, Jun Zhang, Jian-Feng Xiang,Li Yang, and Ling-Ling Chen (2016). Unusual Processing Generates SPA LncRNAsthat Sequester Multiple RNA Binding Proteins. Molecular Cell, Published Online.
Mandel, C.R., Kaneko, S., Zhang, H.L., Gebauer, D., Vethantham, V., Manley, J.L., and Tong, L. (2006). Polyadenylation factor CPSF-73 is the pre-mRNA 3 "-end-processing endonuclease. Nature 444, 953-956.
Yin, Q.F., Yang, L., Zhang, Y., Xiang, J.F., Wu, Y.W., Carmichael, G.G., and Chen, L.L. (2012). Long noncoding RNAs with snoRNA ends. Mol Cell 48, 219-230.
文 | circRNA 吉賽生物
本文為作者授權肽度時界發布
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※山東大學教授Nature Immunology
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