業界重量級前瞻性綜述：無創產前基因檢測以後能查什麼？

基因組異常是出生缺陷和妊娠併發症的主要原因，包括在子宮內生長發育遲緩和流產的風險。傳統的侵入性方法檢測這種基因組異常對母親和胎兒都有風險。非侵入性產前檢測（NIPT）是一種通過分析母體血漿或血清循環DNA獲得子宮內胎兒的基因組狀態的方法。越來越多的醫生和醫院可能使用NIPT，該技術推廣到其他診斷的應用潛力也是巨大的。在這個時候Cell旗下的Trends in Molecular Medicine在11月份的刊物上推出了一期關於NIPT前瞻性綜述。這篇綜述討論了NIPT診斷的最新進展，它的應用和局限性，以及未來技術的發展和可能的臨床應用。

非整倍體的檢測和其應用

檢測胎兒的染色體的非整倍體是醫生和准媽媽的主要目標。對於不同的組進行染色體非整倍體的檢測基本上特異性超過90%，仍有有待提高的空間。二代測序的發展讓大規模並行基因組測序（massively parallel genomic sequencing）定量母體血漿DNA序列成為可能，這個方法能在14周懷孕時就能成功測出胎兒21號染色體的三體綜合征。研究證明此方法能檢測出任何染色體的非整倍體，包括通常出現在13、18和21號以及X、Y染色體上的非整倍體。

用NIPT檢測亞染色體異常

亞染色體的異常指的是基因組中的缺失和重複，儘管已經有一些研究顯示了NIPT從母體血漿中檢測胎兒染色體缺失/重複的潛力，但是檢測亞染色體異常需要深度測序，在費用和花費時間上都有所增加。目前在半導體測序平台（SSP）上，有研究通過提高cfDNA的含量促使測序深度增加，提高對異常的檢出。在3.5M的reads中，陣列比較基因組雜交（aCGH）可以檢出71.8%的亞染色體異常。

NIPT檢測單基因突變

這個技術一個潛在的應用可能就是準確可靠地檢測胎兒單基因異常，這要求鹼基水平上的解決方案，給出因插入、缺失或者單鹼基突變造成的單個基因異常。然而，在單基因疾病中實施NIPT的可能性，已經使用如相對突變數（RMD）的方法在地中海貧血、血友病和鐮狀細胞病證實。其他分析包括了全基因組測序的單核苷酸多態性和先天性的腎上腺皮質增生症（CAH）和地中海貧血的相對單體型劑量，以及Wilson病直接的線性放大與量化。NGS通常檢測的流程如圖1 所示。當提供了父母和先證者單倍型的信息，胎兒的單倍型就能夠構建，遺傳疾病可以被檢測。

圖1 運用二代測序進行NIPT的總括

相對突變劑量與單體型劑量分析

對於父母都是常染色體隱性遺傳疾病攜帶者，或者母親有常染色體顯性遺傳類疾病特徵，攜帶者具體突變的定性分析是不夠的，一種稱為相對突變劑量（RMD）的分析是必要的。而數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術，可讓你能夠直接數出DNA分子的個數。數字PCR的運用讓RMD技術作為一種方法發展，可以分析出母體血清中某一等位基因突變的平衡或不平衡，從而使胎兒的基因狀態可鑒定。具體機制見圖2。

圖2 相對突變劑量分析（RMD）

最近發現在孕婦血漿DNA進行SNP基因分型和深度測序，在構建胎兒全基因組的遺傳和突變地圖時是有用的。這種聯合分析的基本原理是通過母體血漿中單倍型的相對濃度推導出來的，這個過程稱為相對單體型劑量分析。具體方法見圖3.

圖3 相對單體型劑量分析（RHDO）

運用線性放大對突變的等位基因定量

為了改善等位基因比例的檢測結果和真實值的偏差，一種新的利用環化單分子擴增和重測序技術（cSMART）被研製成功。該技術的具體流程見圖4，在此過程中具有獨特條碼的單分子擴增產物被富集和測序，但只計數一次，消除潛在的PCR擴增偏差，確保血漿樣本中DNA突變位點比例更精確的定量。cSMART技術通過母體血漿中DNA的突變比例就可以確定胎兒是否患有單基因疾病。

圖4 線性放大：cSMART技術

挑戰和未來方向

利用循環DNA作為一種診斷工具就面對了一系列的挑戰：它們的量比較低，而且在一定條件下敏感性也是波動的。在早孕10-20周，通常cfDNA丰度低於10%。有研究證明，NIPT對於某些人群可能不是適用的工具。比如胎兒cfDNA的含量與母體的BMI呈負相關，在肥胖的孕婦中下降。

值得注意的是染色體非整倍體不佔精神發育遲滯兒童的較大比例，染色體重排已經被鑒定是顯著的部分。應用NIPT和DNA測序可能會揭示這些重排是否發生在子宮內。

如果母體患有癌症，NIPT會獲得不一致結果。基因組的不穩定性是所有癌症的特徵，包括染色體13, 18, 21, X和 Y。在處理NIPT正結果時包含了這樣複雜的情況。對癌症影響NIPT結果的進一步調查，對這個診斷方法在臨床上廣泛應用前是很有必要的。

另外影響NIPT精確度的複雜情況是胎盤內特異的嵌合體。胎盤染色體組成的差異可能會影響胎兒非整倍體的準確測定。

另一個在混淆NIPT結果的因素是雙胞胎的存在。同卵雙胞胎中，NIPT技術仍然適用；然而在異卵雙胞胎中，除非雙胞胎是不同性別的，否則我們很難確定突變位於哪個胎兒。

隨著技術的進步，深度測序和單分子PCR技術的出現將讓科學家們探索更多的胎兒特異基因組異常。

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