CAPP-Seq：液體活檢領域正在升起的一顆新星
作者：解螺旋.麥子
導語
液體活檢在近年來漸漸成為熱點，是許多實驗室爭相探索的很有前景的領域，但其臨床應用遲遲未能推廣，很大一個原因是缺乏高靈敏性和高特異性的方法。現有一支來自斯坦福的隊伍殺出重圍，為腫瘤液體活檢的臨床應用增加了一點希望。
11月9日，《Science Translational Medicine》發表了《Distinct biological subtypes and patterns of genome evolution inlymphoma revealed by circulating tumor DNA》一文，兩位通訊作者Ash A. Alizadeh和Maximilian Diehn來自斯坦福大學癌症研究所。
他們的團隊用CAPP-Seq法對瀰漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）患者的組織樣本和血液樣本中的循環腫瘤DNA（ctDNA）進行深度測序，提取腫瘤個體化特徵，確認了兩者是相匹配的，並且有較高的敏感度和特異性，從而打開了無創的ctDNA替代傳統組織樣本活檢的新希望。
左：Ash A. Alizadeh；右：Maximilian Diehn
還記得今年的引文桂冠獎的華人獲獎者盧煜明嗎，他最耀眼的成就是在母親血液中捕獲胎兒DNA進行產前檢查，這種腫瘤液體活檢的理念是一脈相承的，現在他的團隊也轉向了這個應用領域。
液體活檢的雀起
然而液體活檢儘管理念很好，在實驗室里研究得也風聲水起，但在臨床上卻羽翼未豐。
早些年的液體活檢還只是通過對血液中的循環腫瘤細胞（CTC）進行計數，但去年年底，唯一獲得FDA和CFDA批准的檢測CTC的臨床商業化產品，強生的CellSearch宣告停產，給液體活檢的臨床應用罩上了一層陰霾。據報道，在北京引進這個產品的六七家醫院中，平均每年接下的檢查單才一兩百例。
接下來是ctDNA的檢測，在此之前，技術上大體上分為三類，一類是以數字PCR（dPCR）為核心，一類是以二代測序技術為核心，還有一類則是結合了dPCR和流式技術的BEAMing技術。但很遺憾，ctDNA和CTC一樣，在血液中的含量非常少，占所有循環遊離DNA（cfDNA）的比例不到1.0%，背景噪音也是個大問題，這就要求檢測技術達到極高的敏感性。
數字PCR具有極高的敏感性，但只能針對確定的SNP，而且通量相對較低；BEAMing能在10000個野生型等位基因中擒獲1個突變，但它的探針必須通過組織活檢獲取突變特徵來進行個體化處理；而二代測序則比較振奮人心，能獲得全基因組數據來進行篩查，但這也就是問題所在，這麼大量的數據要怎麼管理，必須得有生信老司機的參與，更別說成本了。
CAPP-Seq的優勢
斯坦福這支團隊最重要的突破當是技術上的創新。他們研發的CAPP-Seq法（cancer personalized profiling by deepsequencing，腫瘤個體化分析深度測序法）首次報道是在2014年的《NatureMedicine》，當時是在非小細胞肺癌（NSCLC）中進行測試。
CAPP-Seq法的關鍵，是聯合資料庫檢索和多階段生物信息學方法，來設計一個由生物素化的寡核苷酸組成的「篩選器」，靶向腫瘤的突變區域，直接應用於待測的循環DNA，來識別腫瘤相關的基因突變，從而直接進行ctDNA的定量測定。
這個篩選器是從腫瘤基因突變資料庫（COSMIC）等來源中，納入可能的驅動基因中反覆出現突變的外顯子，再對腫瘤基因圖譜庫（TCGA）的407名NSCLC患者的全外顯子測序（WES）數據，運用迭代演算法找到最大量的錯義突變，而使篩選器長度最小化。
篩選器設計的各個階段
第1階段：納入基因組中包含已知的和可疑的NSCLC驅動突變的區域；第2-4階段：從TCGA的肺腺癌和肺鱗癌患者（n=407）的WES數據中增加包含反覆出現的SNV的外顯子。第5、6階段：增加預計的NSCLC驅動外顯子、內含子和含有ALK、ROS1、RET突變的外顯子。底圖：各個階段篩選器長度的增長。
這個篩選器長度約為125kb，包含了139個反覆出現的突變基因中的521個外顯子及12個內含子，平均能夠識別4個單核苷酸突變（SNV）。CAPP-Seq是諸多以二代測序為核心的方法中，第一個能夠在理想的成本範圍內，達到超低的檢出限並能覆蓋大量患者的方法。
今年五月，該團隊在《NatureBiotechnology》上發表了CAPP-Seq的改良版，引進了集成數字錯誤抑制（integrated digital error suppression, iDES）的方法，使CAPP-Seq的靈敏度又有了很大的提高。仍然在NSCLC中進行測試，在基因變異層面上，對EGFR激酶域突變的敏感度達到92%，特異性則>99.99%，而在患者層面，則有90%的敏感度和96%的特異性。
CAPP-Seq在淋巴瘤中的應用
這個方法的研發的初衷，就是要針對所有的實體瘤。這兩年在非小細胞肺癌上取得了較理想的效果，研究團隊又馬不停蹄地向淋巴瘤進軍。這回他們選取了較為複雜的瀰漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）。
他們嘗試用CAPP-Seq法鑒定各DLBCL患者的基因型。在基因型已知的情況下，用CAPP-Seq法檢測，特異性可達99.8%。此外，由組織活檢確定的驅動基因中SNV，經血漿檢測可認別91%，且檢出率與ctDNA濃度呈正相關。
在腫瘤複發的早期診斷方面，CAPP-Seq法可檢測到早期極微小的複發跡象，從發現第1個陽性ctDNA到確診臨床複發的平均時長是188天。Diehn說，這是因為要用影像學方法觀察到1cm的體積變化，腫瘤就已經多長了十來億個細胞了，但本法可以檢測到1百萬個細胞中1個分子的變化。也就是說，我們可以提前半年對複發的腫瘤進行及時干預。
11位複發的患者中ctDNA檢測隨時間的變化，及臨床影像學檢查確診複發的時間對比。mo：months。想像一下要是那些表示液體活檢的圈圈都變成了組織活檢，該有多痛苦。
同時，對使用依魯替尼（ibrutinib）治療的患者進行CAPP-Seq測定ctDNA基因型，他們還找到了BTK的突變，這種突變原來只在依魯替尼抵抗的慢性淋巴細胞性白血病和套細胞淋巴瘤中觀察到。此外，他們還檢測到了與不良結局、對現行療法的反應、治療抵抗相關的特異性基因變異。
他們做了這麼多豐富細膩的實驗，獲得了這樣具有誘惑力的成果，什麼時候能上臨床？
很遺憾，現在還差那麼一點點……這個研究也只是證明了可行性，但還不足以推廣臨床應用。Diehn表示，他們下一步要做獨立的隊列研究。下個月在聖地亞哥舉行的美國血液病學會的年會上將要發布兩個有效性研究。
最後還要看CAPP-Seq是否能通過終級測試，即在前瞻性臨床試驗中能改善患者的結局。現在設備、技術都已準備好，就差一個CLIA認證的實驗室進一步驗證。CAPP-Seq法屬於目標序列捕獲測序，大大地節省了測序成本，早在剛發表之時就有聲音說，它將成為拯救液體活檢的新希望。現在經過這兩三年的醞釀，已經有了可喜的發展，是不是離夢想更接近了一些呢？
參考資料：
1．LiquidBiopsies Reveal Complex Landscape of Lymphoma
2．Anultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patientcoverage
3．Integrateddigital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA
4．Distinctbiological subtypes and patterns of genome evolution in lymphoma revealed bycirculating tumor DNA
5．Liquidbiopsy: monitoring cancer-genetics in the blood
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