CRISPR：So easy？一名記者的CRISPR初體驗

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生物學家Roland Wagner（左）指導Jon Cohen進行構建CRISPR系統。

是不是真的連傻瓜都能使用CRISPR這一基因編輯工具呢？

我對生物學相關知識有一定了解，但當我查閱新基因編輯技術CRISPR相關知識的時候，我卻有些望而卻步，該技術看起來非常複雜！但一位研究人員告訴我，CRISPR（全稱clustered regularly interspaced short palindromic repeats）只是聽起來嚇人，用起來非常簡單，傻瓜都能用。我自認為還是比傻瓜聰明得多，便打算驗證一下這句話的真假。

於是，我就愉快地開始了我的CRISPR初體驗。

相關資料顯示，CRISPR在遏制或敲除基因上效果最佳，因此我打算試用CRISPR來敲除基因（如果想看視頻，請參見bit.ly/vid-6312）。我設定了一個宏大的目標：用CRISPR敲除一個免疫基因，我猜想，敲除該基因，可以減少Zika病毒所造成的傷害。一旦成功，這將大大推動Zika病毒相關研究！（我的假設是，如果某個個體曾感染過登革熱，並有該病毒的抗體，那麼CD32可能有助於驅動Zika病毒的自我複製。）

Roland Wagner是加州聖地亞哥Sanford Burnham Prebys醫學發現研究所Sumit Chanda實驗室的博士後，他同意擔任我的CRISPR指導員。Wagner來自奧地利，是一個經驗豐富的攀岩愛好者，喜歡有條不紊地完成工作。他查找分析了CD32基因的序列，CD32具有五個不同的蛋白質編碼區。如果我們切割其中一個蛋白編碼區的DNA，該基因最可能被敲除——它將不再表達CD32蛋白。

CRISPR使用嚮導RNA將分子剪刀——CRISPR的一部分，Cas9——導向到基因組中的精確位點。我們可以買到嚮導RNA（gRNA），但Wagner並不打算這麼干。他指出，他不確定gRNA的價格是多少，但假設購買gRNA要花500美元，他們自己合成，就只要5美金。

gRNA序列能與我們想要切割的CD32基因上的一段長度為20個核苷酸的序列互補。但是，基因組中的其它地方也可能存在與這段短序列一樣長的片段，並會導致分子剪刀切割錯誤的位點。這種「脫靶」效應會嚴重地影響實驗結果，消除脫靶效應是研究CRISPR的關鍵目標。為了使CRISPR更具特異性，在靶向的20個核苷酸外，Cas9還需要一段額外的序列：N-G-G，其中「N」可以是任何核苷酸。當Cas9在20個目標核苷酸後發現N-G-G時，立刻結合并打開DNA雙螺旋，隨後gRNA與目標序列相結合。最後Cas9切割DNA的兩條鏈。

為了自製gRNA，Wagner把我們鑒定的CD32序列粘貼到免費資料庫Optimized CRISPR Design中，查找緊挨著N-G-G的、符合我們要求的20個核苷酸序列。CD32中有41個可選片段。資料庫掃描整個人類基因組，檢查是否其它地方也存在相同的序列——潛在的脫靶位點。我們選擇了一個僅存在於CD32中的序列。然後Wagner打開另一個網站，訂購該段DNA序列。

DNA序列到貨了，我第一次嘗試了使用移液槍。自從我30多年前畢業以來，我就沒有在實驗室工作過。那時，我學會了一種可能是由Louis Pasteur發明的移液技術：我把一根手指放在我的嘴裡，然後把一種化學品吸到一個薄的玻璃管里，吸足了量後，就用指尖捂住玻璃管。

現在，在Wager的實驗室工作台上，我拿著一個看起來像噴槍的花式塑料小玩意，但是只要按一下，就能移取精確體積的微量液體。我的任務是將DNA序列從一個小試管移到另一個小試管中。第二個試管含有質粒——一種起到特洛伊木馬作用的環形DNA片段。這個質粒是CRISPR實驗定製的，裡面已經包含了Cas9基因。它還含有60個核苷酸的「髮夾」序列，這些序列最終將和那20個核苷酸鏈接在一起，形成完整的gRNA。

我用神奇的移液器把寡核苷酸轉移到了質粒管里，添加緩衝液、水和酶。如果一切順利，酶將切開質粒，切除一段DNA，並用gRNA替代這一段序列。但悲劇的是，實驗進展不順利。

當我移取酶的時候，Wagner指出，我的操作失誤了！我在把吸頭浸入液體之前，就按了吸取液體的按鈕。

終於完成了一系列操作。在等待化學反應發生後，我們將CRISPR質粒帶到電泳儀——一個有電線的托盤上。我們開始配膠，然後把CRISPR質粒滴加到不同泳道里。然後開始施加電壓，這種凝膠電泳是根據分子質量將DNA分成不同的條帶。用酶切出的小片DNA會形成明顯的條帶。

我的凝膠電泳只有一條帶，來自質粒的條帶。

「看來我們是失敗了，」 Wagner輕輕地說。「可能是你吸取酶的時候沒吸到。」他說，剛開始做實驗的時候，都會出各種差錯。「這種時候，我會想回家。會有一種特別挫敗的感覺。畢竟科學家的生活總是容易充滿挫折的。」

我已經知道，不是任何傻瓜都能做CRISPR：至少，你得掌握基本的實驗室技能。

Wagner與我同時進行實驗，他的質粒正確地整合了gRNA和Cas9。然後，我們把質粒導入來自胚胎腎的細胞株中。幾天後，我們從細胞中分離出DNA，用聚合酶鏈反應進行擴增，並使用電泳驗證CD32基因已被切成片段。感謝上帝，我們終於成功敲除了CD32基因！！

「你做得很好，」Wagner安慰我說， 「走吧！」

但說實話，我做得不好。但是CRISPR確實很好，很簡單。

Jon Cohen. (2016) A reporter does CRISPR. Science, 354 (6312): 541.

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