調控睡眠和做夢的基因：日本科學家的最新發現

知識 11-09

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編者按：

今年10月初日本大隅良典獲得其本世紀第17個自然科學諾獎引起很多中國人的感慨和思考，而11月第一期的《自然》又刊出日本筑波大學科學家柳沢正史教授發現哺乳類控制睡眠的基因。無獨有偶，與大隅良典諾獎工作一樣的是，柳沢正史等也用遺傳篩選。

二十多年前日本科學家是用單細胞生物酵母研究細胞水平的生物學問題（細胞內自噬），而現在日本科學家是用比酵母高等很多的老鼠研究系統水平的生物學問題（生物體睡眠）。用腦電圖（EEG）作為檢測睡眠的指標，用老鼠篩選基因突變種，耗資多、時間長，需要痛下決心，柳沢正史帶領他的團隊做到了。他們做出了迄今哺乳類睡眠領域最重要的基因水平的發現，刷新了柳沢正史和旅美法國科學家Emmanuel Mignot於1999年分別獨立發現神經肽orexin及其受體參與睡眠調控的記錄（實驗是用小鼠做的，其中睡眠可以檢測，但做夢是推測：並沒有辦法知道小鼠是否做夢）。

這一突破將把睡眠研究提高到什麼程度，下面十年我們拭目以待。

撰文 | 魯伯塤（復旦大學生命科學學院）

責編 | 陳曉雪

中人有夢君無夢，

樂思幽懷事不同。

為問曲肱高卧日，

如何合眼見周公。

——《贈無夢道人》宋代詩人王遂

清晨醒來，我不禁又陷入了深深的思考，是什麼昨晚又讓我陷入沉睡，「浪費」了6、7個小時的生命。有人嘆，「紙衾瓦枕冷如水，輾轉無夢睡不成」；亦有人道：「戀枕嫌多夢，開簾曙色迷」；可謂「中人有夢君無夢，樂思幽懷事不同」。每個人每天都要睡覺，各人睡覺的長短有不少差異，卻又在一定的範圍之內。控制睡眠的「看不見的手」究竟是什麼呢？

我們為什麼需要睡眠？

睡眠是一件細思恐極的事情。從低等的無脊椎動物到人類都會進行睡眠。試想一下，人類的祖先或者現在的動物，在睡眠時防禦和逃跑能力幾乎喪失，對突發的環境變化的適應能力也大大降低，因此極其容易在睡眠中失去生命。另一方面，即使沒有上述的危險，睡眠也會造成巨大的代價。如果有方法能夠延長一個人十年的壽命，我想大多數人都會願意用幾乎一切代價去換取。然而睡眠累計起來即佔據了近三十年的壽命！可以看到，睡眠是一個大多數動物都會進行，而代價巨大的行為，所以它也必然是一個至關重要而又收益極大的行為。研究已經發現，長時間缺乏睡眠會導致神經功能下降，甚至猝死。近年來發現睡眠為維持神經可塑性所必須，並且可以幫助大腦「洗澡」從而清除其運作時產生的「垃圾」【1】。賓夕法尼亞大學的Amita Seghal課題組最近還在果蠅模型中發現，睡眠不足會導致產生的後代數目嚴重減少【2】。「不孝有三，無後為大「。如果Seghal教授的結論能推廣至其他動物的話，那麼可能可以解釋為什麼各種動物都有睡眠行為：產生後代的能力是如此重要，以至於影響此能力的基因在進化中會迅速被淘汰，從而消失在歷史的長河中。因此，儘管產生睡眠的進化原因還並不完全清晰，睡眠毫無疑問是一種至關重要乃至可能為動物生存繁衍所必須的行為。

睡眠遺傳學

睡眠如此重要，但我們對它知之甚少。小時候我就經常夢想有一個開關，把它開了，人就醒了，把它關上，人就睡著了。長大了，對科學有一定了解之後，我知道了有一些控制生物鐘的基因，它們通過負反饋控制自身表達量的變化，最終控制動物什麼時候睡覺。除了控制什麼時候睡，控制睡多長也非常重要。然而控制睡多長的基因有哪些，它們如何工作，我們幾乎一無所知。

如果在50年前，我提出「哪些基因控制睡眠時間」這樣的問題，大概會被科學界認為是「傻子」（也許比某大國的總統候選人被認為「瘋子」或者」騙子「要好一些）。事實上，20世紀60年代，當神經遺傳學鼻祖之一Seymour Benzer向加州理工學院的同事闡述神經遺傳學（neurogenetics）的想法時，Sydney Brenner（1927-，2002年諾貝爾生理學或醫學獎獲得者）和Gunther Stent（1924-2008，以細菌新陳代謝研究聞名）等大牛給他的回應是：「怎麼可能通過遺傳突變體發現大腦如何工作（How was one going to find out anything about how the brain works by studying mutants）？」、「他蠢到家了嗎（Was he foolish enough）？」甚至，1971年Seymour Benzer發現第一個控制生物節律行為的基因per的時候，他的同事Max Delbruck還評論說「我一個字也不相信！」（I don』t believe a word of it）——雖然Delbruck後來很快成為Benzer最重要的支持者之一。

隨著控制重要神經系統功能（例如生物鐘、求偶、記憶等）的重要基因被發現，科學界逐漸承認了複雜的神經功能在很大程度上也受基因控制。

回到睡眠，睡眠的長短又由哪些基因控制呢？邏輯上我們可以用兩種方法研究這個問題。我們先根據已有的線索做出猜測，哪些基因可能會影響睡眠的長短。然後使這些基因一個個發生突變，看睡眠長短是不是真的受到影響。這種從特定的基因出發，研究其突變後對錶型的影響，就叫做反向遺傳學。因為基因是隱藏在表型背後的根本，我們從改變表型背後的根本出發，研究顯現出的表型，所以是反向。人和動物大多數都有幾萬個表達蛋白的基因，還有非常多「非編碼」的基因，對於睡眠這樣複雜而又所知甚少的行為，從幾萬個候選基因中直接猜到答案，那得祖墳上冒青煙才會這樣幸運，所以反向遺傳學要回答睡眠基因是什麼這個問題，很可能行不通。

那麼用正向呢？如果我們在一大群動物中隨機引入基因突變，然後在這些動物中挑選睡眠長短異常的，在這些異常的動物中再尋找是什麼突變導致其異常，不就能知道睡眠長短受什麼基因影響了嗎？這樣從表型出發尋找對應的基因突變的思路，符合人們由表及裡的認知，就是所謂正向遺傳學。

思路有了，那就要建立方法和模型進行實驗。我們拿什麼動物來研究睡眠的基因呢？要落實到人類的睡眠，最理想的當然是直接拿人來研究。但是人作為研究對象有缺點。首先，無法人為地在人群中主動引入隨機突變。儘管人群存在各種基因突變，但是突變程度有限，睡眠長期太短或者太長的人很可能已經被淘汰，而科學家又不能利用藥物或輻射去誘發更多的突變，因為誘發突變結果的不可測，沒有人會願意接受自己被誘發基因突變。其次，用人做實驗的成本很高。要組織大量的空間及儀器進行觀察記錄，還要找足夠的人配合研究，最後還要做全基因組測序找突變……當然人群的數據還是有用的，比如有些睡眠極少的家族，對我們尋找睡眠基因就非常有幫助。

除了人之外，正向遺傳學研究最常用的模式動物之一是果蠅，果蠅可以理解為喜歡吃水果的一種蠅。學過中學生物課的人都知道，摩爾根利用果蠅發現了染色體遺傳理論。前文提到的Seymour Benzer也是用果蠅做實驗的大家。果蠅在基因操作上有著成熟的系統，特別適合做正向遺傳學。此外，果蠅繁殖快，容易短時間內得到足夠的數量，適合用於研究表型。

利用果蠅研究睡眠其實在十幾年前還是很有爭議的事情。筆者2004年還在賓夕法尼亞大學讀書的時候，就知道那年有一位大牛實驗室發現了控制果蠅睡眠的腦區，投稿給Nature，結果沒送審就直接被小編（editor）拒稿了，理由是該領域沒有足夠的證據表明果蠅會睡眠。大牛很生氣，直接打電話給編輯進行了長達一個多小時的「子非蠅，焉知蠅不睡」 vs 「子非蠅，焉知蠅會睡」的辯論（辯論是有的，內容純屬杜撰）。最後的結果是editor（編輯）把文章送審，而且過了一個多月就發表了。後來，隨著證據越來越多，果蠅會睡覺這個結論現在已經沒有什麼爭議了。只是，拿果蠅做睡眠長短的篩選研究還是有局限的。由於果蠅很小而數量多，篩選時基本上只能根據其運動來判斷睡眠（比如，果蠅連續5分鐘以上不動則被判斷為處於睡眠狀態）。但是我們知道，人經常會假寐，甚至還會葛優躺，清醒的時候持續5分鐘以上不動也是很有可能的。而縮小到果蠅的尺度，它們五分鐘不動，卻可能沒有睡覺，只是假寐或者葛優躺等，但是由於果蠅很小，看不出來這些情形的區別。

儘管有以上的局限，果蠅還是研究睡眠很好的系統，並且為」睡眠遺傳學「做出了重要的貢獻，比如，第一個睡眠基因shaker就是果蠅中篩選發現的【3】。

小鼠也是做遺傳學常用的模式動物。與果蠅相比，小鼠研究睡眠有一大優勢：除了觀察行為，我們還可以通過測量小鼠的腦電圖來判斷其是否睡眠。這樣測量睡眠的方式更直接，得到的數據更「乾淨」，並可以區分假寐、葛優躺和真睡，甚至還可以區分做夢與不做夢（腦電圖紀錄到的REM睡眠在人類與做夢相關，小鼠有REM睡眠，故而有推測也許也與做夢有關——如果小鼠有夢的話）。我們今天將要討論的文章「Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice（隨機突變的小鼠的睡眠的正向遺傳學分析）」就是利用小鼠通過正向遺傳學篩選發現的新的控制睡眠長短的基因。這個由日本著名學者、筑波大學國際整合睡眠醫學研究所所長、醫學醫療系教授柳沢正史（Masashi Yanagisawa）帶領完成的重要研究剛剛在線發表於Nature【4】。

小鼠睡眠的遺傳學篩選

調控睡眠和做夢的基因：日本科學家的最新發現

論文實驗部分的第一段就讓我震驚了：研究者用化學誘變劑ENU在很多雄性小鼠中誘發了隨機的基因突變，然後與野生型雌性小鼠雜交，並測量了雜交所產生的超過8000隻子一代小鼠（F1）的睡眠表型。總計上萬隻小鼠的工作量，光養小鼠就要幾百萬（人民幣）！所以我的小實驗室萬萬不敢想這樣的實驗的。而且即使我有錢，也不一定做的起來，因為學生可能會跟我說：「我不想養這麼多小鼠，我要畢業！」事實上，根據文章第一作者Funato2013年給我的郵件，他們在3年半以前就已經完成了篩選，而到最近不久才發表文章……我只能感慨一句，真的很佩服這些日本學者！

他們檢測小鼠睡眠的方法就是前面提到過的測腦電圖。具體來說，他們根據清醒，非眼快動睡眠（NREMS，可以理解為睡著且沒有做夢），以及眼快動睡眠（REMS，可以理解為睡著而且做夢）時腦電波的波形特徵的不同，測量了每隻小鼠在一天24小時內各種狀態的時間，並通過大量的測量，找到了睡眠不正常的小鼠。通過這些信息，可以找到睡眠不正常的小鼠家系（pedigree），並且利用這些家系中產生睡眠不正常子代的父親（父本）的精子做人工授精，進一步驗證其基因突變是造成睡眠異常的原因。

明確了突變與睡眠異常的原因之後，就要在基因圖譜上找到具體是哪個突變導致的，這個定位的過程叫做mapping。研究者採用了比較巧妙的方法，他們誘變的父本都具有一樣的遺傳背景（B6J），而雜交用的母本則有另一個遺傳背景（B6N）。這兩個遺傳背景的睡眠沒有什麼差別，但是兩者的基因組在特定的不同位置具有特定的核苷酸，這些位置被稱為單核苷酸多態性（SNP）。這些SNP會在子代中按遺傳學規律分布，成為了基因組圖譜上的「地標「。而比較睡眠異常的子代與正常的子代中SNP分布的不同，就可以找到推斷導致睡眠異常的基因的大致位置。再結合全基因組測序，就可以明確是哪個具體位置的突變導致了睡眠異常。用上述方法，柳澤找到了兩個睡眠異常的家系「嗜睡」（Sleepy）和「無夢」（Dreamless），分別對應了兩個關鍵的睡眠基因，Sik3和Nalcn。

「嗜睡」的基因突變

顧名思義，「嗜睡（Sleepy）」意為睡得很長，這一家系的小鼠每天只有524分鐘（8.7個小時）是清醒的，遠遠低於正常小鼠的清醒時間（約13個小時）。進一步分析數據可以發現，嗜睡家系（Sleep）小鼠非快速眼動睡眠（NREMS）時間增加，也就是多睡了，但並沒有多做夢。睡得多可能有三個原因，一個是被喚醒的能力差了，比如用鬧鐘都叫不醒；一個是生物鐘亂了，導致感受的時間和真實的時間不一樣；最後一個是喜歡睡，睡到自然醒的時間很長，但是被喚醒的的能力不變。

為了驗證以上三個原因，研究人員做了換籠子、喂咖啡因等喚醒實驗，也檢測了嗜睡小鼠的生物鐘，發現嗜睡小鼠被喚醒的能力沒有減弱，生物鐘也正常。因此，突變使得小鼠喜歡睡，睡到自然醒的時間變長最有可能解釋小鼠嗜睡的現象。進一步的實驗和分析發現，這些小鼠清醒時的腦電波的慢波活動（slow-wave activity）也遠多於正常小鼠，表示它們清醒的時候其實也經常犯困。此外，強制它們幾個小時不睡覺之後，它們補覺時間遠比正常小鼠多。總之，它們真的就是愛睡覺啊，Sleepy（嗜睡）這個名字真的名副其實。

那麼，嗜睡對應的基因是什麼呢？通過定位，發現嗜睡家系小鼠在一個叫Sik3的激酶基因的一個內含子中的突變，是導致表型的原因。內含子本身並不參與編碼蛋白，但是Sik3的這個突變在內含子中剪切體識別的位點，導致Sik3的mRNA剪切錯誤，少了一段（exon13，即第13個外顯子），最終導致Sik3蛋白缺失了一段。為了驗證Sik3蛋白缺失了這一段是導致小鼠嗜睡的主要原因，研究者們利用基因編輯的手段在正常小鼠中製造了Sik3基因第13個外顯子的缺失，結果發現表型和嗜睡小鼠一樣，從而證明了他們的假設。

調控睡眠和做夢的基因：日本科學家的最新發現

Sik3 mRNA在前腦神經元中被廣泛表達。來源：Funato H, Miyoshi C, Fujiyama T, et al. Nature . 2016

為什麼Sik3缺失了這一小段幾十個氨基酸就影響到睡眠呢？研究者們發現，這一段的序列高度保守，也就是從線蟲到人，這一段的蛋白序列幾乎一樣，而且都包含了一個被PKA磷酸化的RRAS位點（其中的絲氨酸S會被PKA磷酸化）。因此，作者們猜測，這個磷酸化位點的缺失可能導致了Sleepy的表型。他們繼而在果蠅中，在不改變內源野生型Sik3的情況下，誘導表達磷酸化位點突變為丙氨酸的Sik3（S563A，即無法再被PKA磷酸化），導致果蠅很快變得嗜睡。這不僅證明了PKA磷酸化位點的重要，而且也預示著這個Sik3突變很可能是一個功能獲得型突變（gain of function）。一個蛋白突變導致表型有兩種可能：一種是突變導致蛋白功能喪失，另一種則是突變使得蛋白與野生型不一樣，獲得了新的功能。在這個實驗里，野生型Sik3並沒有被影響，所以表型應該是Sik3_S563A表達的蛋白具有的新的功能引起的。然而，我們也不能排除Sik3_S563A抑制了野生型Sik3的功能從而導致這種表型的可能。

調控睡眠和做夢的基因：日本科學家的最新發現

產生嗜睡基因突變的小鼠（紫色）清醒時間低於攜帶Sik3野生型基因的小鼠。來源：Funato H, Miyoshi C, Fujiyama T, et al. Nature . 2016

為了進一步驗證Sik3突變是否為功能獲得型突變，研究者們檢測了Sik3功能缺失或敲除的果蠅和線蟲，發現它們的睡眠時間變短了，而非變長，與嗜睡小鼠相反。這證明了Sik3功能喪失並不會導致嗜睡的發生，反而會導致睡得少。因此，嗜睡小鼠的突變不是功能喪失型突變，而是是功能獲得型突變（這裡為什麼不做敲除小鼠了呢？也許是Sik3敲除了會致死，也許是日本人也忍不了想趕快投文章了吧……）。

綜上，作者們發現的第一個控制睡眠長短（但非做夢長短）的Sik3基因，它表達的蛋白如果不能被PKA磷酸化會導致嗜睡。未來也許可以由此開發PKA的激動劑抑制睡眠，阻斷劑用於增長睡眠呢！

「無夢」的基因突變

日本人發現的另一個睡眠基因Nalcn與筆者很有淵源。事實上，Nalcn這個名字是我和我的博士生導師Dejian Ren教授命名的。我和我的導師都是中國人，所以基因名字里有中國的代號CN。實際上，這個名字代表Na leak channel nonselective。我們發現Nalcn表達的離子通道蛋白在神經處於靜息狀態時，傳導了一個很小的背景鈉離子漏電流。儘管這個電流很小，但流入的陽離子也足以使得神經元的跨膜電位發生幾毫伏的變化，更接近神經元進入興奮狀態的閾值，從而增加其發放動作電位的幾率，也就增加了神經的興奮性。因此，這個基因的缺失，會導致神經興奮性降低、呼吸等節律行為喪失、小鼠出生24小時內死亡等嚴重後果。與大多數離子通道不同，Nalcn表達的離子通道的電導不受電壓影響，但是會受神經肽和細胞外鈣離子濃度等調控，因此可能參與多項生理及病理過程。近年來的研究也發現這個基因的突變的確是導致多種神經興奮性疾病的原因。

Nalcn在睡眠中起作用，某種程度上可以說是意料之中。睡眠時細胞外鈣離子濃度會周期性變化，我曾經猜測Nalcn可能感受此變化由此控制神經的周期性興奮從而控制睡眠時間。而美國科學家Ravi Allada等人在2015年則根據我已發表的工作及他們的數據提出了Nalcn參與生物鐘節律（Circadian）的「自行車」模型（Bicycle model）【5】。白天活躍時，Nalcn結合蛋白NFL-1的活性增強，導致Nalcn蛋白分子到達細胞膜（上膜）的數目增加，從而增加神經興奮性，動物處於活動期。晚上休息時，NFL-1的活性減弱，導致Nalcn上膜減少，從而降低神經興奮性，動物進入休息睡眠期。

在日本科學家的這篇文章中，作者們發現了Nalcn的突變引起的一個非常有趣的表型：無夢（dreamless）。無夢的小鼠，清醒和不做夢的睡眠總時間相比正常小鼠只有很輕微的增加，而做夢（即眼快動睡眠，REMS）的總時間則減少了近一半（因為REMS的基數小）。進一步的分析發現，做夢減少的原因是做夢的時間碎片化了，從夢境中醒來變得非常頻繁。換句話說，夢境變得非常不穩定（有沒有想起《盜夢空間》？）。

進一步的遺傳學分析發現，無夢這個突變實際上是Nalcn的一個點突變，導致其Nalcn蛋白的315號氨基酸由天冬醯胺變成了賴氨酸（N315K）。通過電生理的記錄發現，突變後的Nalcn通道所介導的電流與野生型電流的性質完全一樣，但是電導要大很多。這樣的直接結果是神經的興奮性增加，小鼠也就更容易從夢境中醒來。與之一致，突變小鼠控制做夢的 deep mesencephalic nucleus（DpMe）神經元的興奮性大大增加，從而可能導致了小鼠夢境的不穩定，做夢也就減少。這很明顯也是一個功能獲得型突變，因為突變使得Nalcn電導增加，而非減少或喪失。這與我們之前的結果一致：增加Nalcn電導會增加神經興奮性，最終導致dreamless（無夢）。而這裡作者們沒有做功能喪失型突變實驗的理由就很充分了——我和博士生導師很多年前就發現了，功能喪失了會死啊……

通過正向遺傳學的方法和上萬隻小鼠的腦電圖測量，柳澤和同事們找到了影響睡眠時間和做夢時間的兩個關鍵基因，不僅意味著我們對睡眠的認識逐漸到達了分子水平，也意味著我們也許以後能找到控制睡眠長短甚至做夢長短的方法或藥物，甚至訂製夢境也並非痴人說夢……

這項研究也帶來很多新的問題：為什麼Sik3的磷酸化能控制睡眠長短？為什麼又要通過PKA控制這一點？為什麼Nalcn突變影響神經興奮性卻隻影響做夢時間？等等。關於最後一個問題，筆者其實有一些想法，歡迎有興趣的科學家們一起討論。

最後，最重要的是，當你睡懶覺，而父母喊你早起時，你可以翻出Nature這篇文章告訴他們：睡懶覺是遺傳的啦！

調控睡眠和做夢的基因：日本科學家的最新發現

北京大學教授饒毅今年2月參加筑波大學柳沢正史組織的學術會議時紀錄其研究，柳沢正史當時公布已經拿到基因，但未公布基因是什麼。

感謝丁澦、馮欣然、崔笑添以及饒毅教授的意見。

參考文獻

1. Xie, L., et al., Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science, 2013. 342(6156): p. 373-7.

2. Kayser, M.S., Z. Yue, and A. Sehgal, A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila. Science, 2014. 344(6181): p. 269-74.

3. Cirelli, C., et al., Reduced sleep in Drosophila Shaker mutants. Nature, 2005. 434(7037): p. 1087-92.

4. Funato, H., et al., Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature, 2016.

5. Flourakis, M., et al., A Conserved Bicycle Model for Circadian Clock Control of Membrane Excitability. Cell, 2015. 162(4): p. 836-48.

6.Lin L, Faraco J, Li R, Kadotani H, Rogers W, Lin X, Qui X, de Jong P, Nishino S, Mignot E (1999). The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2 gene. Cell 98:365-376.

7.Chemelli RM, Willie JT, Sinton CM, Elmquist JK, Scammell T, Lee C, Richardson JA, Williams SC, Xiong Y, Kisanuki Y, Fitch TE, Nakazato M, Hammer RE, Saper CB, Yanagisawa M (1999). Narcolepsy in orexin knockout mice: molecular genetics of sleep regulation. Cell 98:437-51.

作者簡介

調控睡眠和做夢的基因：日本科學家的最新發現

魯伯塤

復旦大學教授，從事神經疾病研究工作。以第一或通訊作者發表多篇研究論文於Nature、Cell、Nature Neuroscience、Neuron、eLife等期刊。

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