回顧2016年國內病毒學界那些令人振奮的重大發現

2017年即將到來，那麼在過去的一年裡，國內病毒學研究領域有哪些突破呢？請跟隨小編一起按時間順序來回顧那些令人振奮的重大發現吧！

1

高福院士團隊破解埃博拉病毒入侵細胞的「第五種機制」

中國科學院微生物研究所、中國疾病預防控制中心高福院士團隊發現了埃博拉病毒感染人體的「另類」機制，為抗病毒藥物提供了新的設計依據，研究結果於2016年1月14日以「Ebola Viral Glycoprotein Bound to Its Endosomal Receptor Niemann-PickC1」為題在線發表在《Cell》上。文章從分子水平闡釋了埃博拉病毒獨特的膜融合激發機制（第五種機制），這種新型機制與之前病毒學家們熟知的四種病毒膜融合激發機制都大為不同，該發現是近年來國際病毒學領域的重大突破。

埃博拉病毒是一類囊膜病毒（絲狀病毒），其對宿主的入侵可以分成兩個重要步驟，首先，病毒粘附到宿主細胞膜表面；然後是病毒通過細胞內吞進入細胞內部，形成內吞體；然後，在內吞體內，病毒表面糖蛋白與內吞體膜上的受體發生相互作用，從而啟動病毒膜與內吞體膜融合，並釋放病毒遺傳物質。之前的研究發現內吞體膜上的NPC1分子是埃博拉病毒入侵所必須的，但是NPC1分子如何介導病毒入侵卻一直是個未解之謎。

高福院士團隊率先解析了NPC1分子的腔內結構域C的三維結構，發現其具有一個由α螺旋和β摺疊組成的球狀核心結構域和兩個突出來的環狀結構。研究發現結構域C主要利用兩個突出來的環狀結構插入激活態糖蛋白頭部的疏水凹槽里，從而發生相互作用。激活態糖蛋白與腔內結構域C結合後，會發生構象變化，使得糖蛋白的融合肽更容易暴露出來，插入內吞體膜上，從而啟動膜融合過程。這一重大發現預示著人們能夠針對激活態糖蛋白頭部的疏水凹槽設計小分子或多肽抑制劑，來阻斷埃博拉病毒的入侵過程，為抗病毒藥物設計提供了新靶點。

2

清華大學醫學院闡述兩種針對埃博拉病毒中和性抗體的作用機制

清華大學醫學院向燁研究組與美國國立衛生院Nancy J. Sullivan研究組和達特茅斯Geisel醫學院Jason S. McLellan研究組合作於2016年2月25日在《Science》雜誌在線發表題為「Structural and molecularbasis for Ebola virus neutralization by protective human antibodies」研究論文闡述兩種針對埃博拉病毒中和性抗體的作用機制。

埃博拉病毒中和性抗體mAb100和mAb114是從1995年Kikwit地區埃博拉疫情暴發時一名埃博拉病毒感染倖存者血清中分離得到。雖然是從20年之前感染病毒的倖存者血清中分離得到，但是這兩種抗體對近40年來所有已知的埃博拉病毒都有中和活性。後續的實驗發現這兩種抗體的作用靶點都位於埃博拉病毒表面糖蛋白GP上。清華大學利用冷凍電子顯微鏡平台的技術優勢，完成了GP蛋白與兩種抗體抗原結合片段（Fab）複合物在兩種不同pH下的冷凍電鏡結構研究，並依此解釋了這兩種高效抗體的作用機制。

研究發現，mAb100結合在GP蛋白的酶切位點處，在空間上阻礙了蛋白酶對GP蛋白的剪切，並且可以使GP蛋白在pH值降低時不發生顯著構象變化；mAb114結合在GP蛋白的受體結合區域，能阻礙宿主細胞的受體與GP的相互作用。兩種抗體通過對病毒進入宿主細胞過程中不同步驟的阻礙，起到了中和病毒，治療疾病的目的。這兩種抗體的結合位點與之前已知的埃博拉GP蛋白抗體的結合位點都不太一樣，尤其是mAb114抗體，它直接結合在GP蛋白的受體結合區域(RBD)，而RBD由於被GP蛋白的其他區域遮蓋，之前的研究認為很難成為抗體的靶點。而這兩種抗體起作用的步驟對所有線狀病毒科的病毒都是共有的，包括對引起前年及去年非洲大爆發的埃博拉病毒以及另一種高致病性的馬爾堡病毒，研究對針對這些病毒的疫苗和藥物開發都可以起到了很好的指導作用。

3

北京大學闡明人類巨細胞病毒和自身免疫性疾病關聯機制

由北京大學人民醫院栗占國教授團隊和軍事醫學科學院楊光教授研究組共同完成的一項最新研究——人巨細胞病毒改變自然殺傷細胞穩態可誘發自身免疫病，相關研究成果於2016年3月9日在《Cell Host Microbe》上發表。該研究在國際上第一次回答了巨細胞病毒與部分自身免疫病相關的共同機制問題。

人巨細胞病毒（hCMV）是一種能感染人並致病的巨細胞病毒，常常悄無聲息地潛伏在人體內，即使人體強大的免疫系統，也不能將之殺滅或清除。一旦機體免疫力下降，它便開始活躍，大肆複製並侵略人體，導致自身免疫病的發生。在我國，自身免疫病是被列入國家中長期科技發展綱要的10類重大疾病之一。

以往研究發現人巨細胞病毒與類風濕關節炎（RA）、系統性紅斑狼瘡（SLE）、乾燥綜合征（pSS）等自身免疫病的發病相關，但其機制不清。該研究利用噬菌體展示技術從RA、SLE和pSS血清中發現了一種新的特異性抗體，可能由hCMV中的pp150蛋白誘導產生。研究員發現，抗Pp150也靶向自然殺傷細胞（NK），誘導補體依賴的細胞毒作用，殺傷NK細胞，導致患者體內NK細胞減少，而NK細胞失衡是導致自身免疫病發病的重要機制。該項研究證明，hCMV可通過影響NK細胞穩態誘導低強度持續性炎症，加深了對自身免疫病發病機制的理解，並發現了新的潛在治療靶點，對認識自身免疫現象及對這一組疾病的合理治療具有重要意義。

4

中國科學家證實寨卡病毒是小頭症元兇

2016年5月11日，《Cell Stem Cell》雜誌在線發表了中科院遺傳與發育生物學研究所研究員許執恆團隊與軍事科學院秦成峰團隊合作的工作：「Zika Virus Disrupts NeuralProgenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice」，通過建立寨卡病毒感染的小鼠模型，證實了寨卡病毒與嬰兒出生小頭症存在確定關係。

2016年4月，美國疾病控制與預防中心（CDC）首次聲稱很可能是寨卡病毒感染導致小頭畸形和其他的出生缺陷。全世界眾多研究機構都在加倍努力，以確認嬰兒小頭畸形和孕婦感染寨卡病毒的關聯性。在這場競賽中，中國科學家與國際同行幾乎同步取得突破，證實了寨卡病毒感染直接導致小頭畸形。

研究人員通過全力合作，首次建立了寨卡病毒小頭畸形動物模型並證實寨卡病毒可以直接導致小頭畸形的發生。他們在哺乳動物小鼠中發現，寨卡病毒可以在胚胎腦中快速複製，並感染神經幹細胞，造成神經幹細胞的增殖與分化異常，及神經元的大量死亡。最終導致大腦皮層變薄及小頭畸形。通過全基因組表達譜分析，他們發現大量與免疫、小頭畸形、寨卡病毒的潛在受體及細胞凋亡相關的基因出現明顯異常。該研究不但提供了第一種研究寨卡病毒導致小頭畸形的動物模型，還為進一步研究寨卡病毒的致病機制和相關治療打下了良好的基礎。

5

武漢病毒所實時動態觀察到單個艾滋病毒的脫殼過程

2016年6月2日，我國中科院武漢病毒研究所崔宗強研究團隊與中科院生物物理所張先恩團隊合作，實時動態觀察到單個艾滋病毒的脫殼過程，揭示了病毒入侵細胞時基質蛋白、衣殼蛋白、病毒核酸等不同層次、不同組分逐級順序解離過程和時空機制，研究成果在《ACS Nano》期刊上在線發表「Real-Time Imaging of Single HIV-1 Disassemblywith Multicolor Viral Particles」。

病毒脫殼釋放遺傳物質的過程是病毒侵染早期階段的關鍵環節，對於脫殼過程的研究也將發現抗病毒治療新途徑。但是，相比較於病毒入侵的其它過程來講，目前對於病毒脫殼的認識還很欠缺，特別是對脫殼過程發生的時空動態機制鮮有了解。利用金屬釕有機配合物([Ru(phen)2(dppz)]2+)、雙砷染料（FlAsH/ReAsH）、和熒光蛋白（EGFP/ECFP）分別對病毒的基因組RNA、衣殼蛋白CA和基質蛋白MA進行熒游標記，構建了具有良好侵染能力的雙色和三色熒游標記病毒顆粒。結合活細胞內單顆粒示蹤技術，對單個艾滋病毒入侵宿主細胞時的解離脫殼過程進行實時、動態、可視化分析，揭示了艾滋病毒在侵染宿主細胞後60-120分鐘期間，病毒基因組、衣殼蛋白和基質蛋白以一個類似於「火箭升空逐級分離」的模式動態順序解離。基於藥物抑制和統計分析，發現病毒解離脫殼過程的時間和效率會受到細胞因子CypA和病毒逆轉錄過程的影響。

6

清華大學醫學院揭示蚊媒黃病毒傳播機制，提出疫苗研發新思路

2016年6月20日，清華大學醫學院程功研究組在《Nature Microbiology》上發表了一項最新研究發現「Flavivirus NS1 protein in infected host sera enhances viralacquisition by mosquitoes」。該研究首次發現了登革病毒（DENV）及乙腦病毒（JEV）非結構蛋白NS1在病毒「宿主-蚊」自然循環中的重要功能；同時成功研發了基於NS1蛋白的新型登革熱雙效疫苗策略，為登革熱的防治提供了新的手段。

蚊媒傳染病是通過蚊媒叮咬傳播給人類及動物宿主的一類疾病。近年來，多種蚊媒黃病毒傳染病，包括登革熱、乙型腦炎和寨卡熱等，對人類的健康產生嚴重的威脅，研究蚊媒病毒感染傳播機制對疾病防治尤為關鍵。在自然界中，蚊媒病毒如何完成「宿主-蚊蟲」的生命周期是一個長期困擾科學界的重要科學難題。

在該項研究中，程功課題組利用體外系統及動物感染模型首次發現了NS1蛋白在黃病毒感染蚊蟲媒介過程中的重要作用。研究發現，感染宿主血清中的NS1蛋白可隨病毒一起吸入蚊子體內，NS1蛋白會通過抑制蚊子腸道免疫系統來幫助病毒儘快跨越蚊子的中腸屏障，並完成對蚊體的感染。在隨後的研究中，程功課題組將優化改造後的NS1蛋白（DENVΔNS1）作為抗原免疫AG6小鼠模型。研究結果顯示，免疫ΔNS1蛋白可顯著降低感染小鼠的出血及死亡率；同時，免疫ΔNS1蛋白可降低蚊蟲的感染率，起到抑制蚊蟲帶毒和動物感染的雙效作用。該雙效疫苗策略可在阻抑人體出現登革出血熱的同時，阻斷登革病毒通過蚊子在自然界的傳播，是一個全新的疫苗設計思路。

7

第三軍醫大學發現控制慢性病毒感染的關鍵CD8+ T細胞亞群

來自第三軍醫大學的葉麗林教授、吳玉章教授和清華大學的祁海教授課題組展開合作，發現了一類新T細胞亞群，CXCR5+ CD8+ T細胞，在T細胞耗竭狀態下控制慢性病毒感染複製，相關研究成果「Follicular CXCR5-expressing CD8+ T cells curtail chronic viralinfection」於2016年8月2日在線發表在國際頂級期刊《Nature》上。這一發現有助於理解慢性病毒感染免疫的關鍵環節，為根治HIV、HBV、HCV等慢性病毒感染提供了新的可能。

急性病毒感染常形成有效的抗病毒免疫應答，初始T細胞經歷克隆擴增，產生大量的抗原特異性T細胞。這些T細胞有的分化成效應T細胞，分泌細胞因子，在快速清除病毒後絕大多數死亡；有的分化為能長期提供保護性免疫的記憶T細胞，當再次遇到同源抗原，能形成有效的抗病毒免疫應答。慢性病毒感染(如HCV, HIV病人等)和癌症患者，體內T細胞由於長期暴露於持續性抗原和炎症，T細胞逐漸失去效應功能和記憶特徵（稱為「T細胞耗竭」），從而使對病毒感染的控制能力大大降低。

為了研究耗竭的CD8+ T細胞中是否存在某類亞群能夠有效控制病毒複製，研究人員利用兩株LCMV分別建立急性和慢性小鼠感染模型（LCMV-Armstrong導致急性感染、LCMV-Cl13導致慢性感染），發現一類LCMV特異性CXCR5+ CD8+ T細胞只在慢性感染中產生。這類細胞傾向定位於B細胞濾泡中，相比於CXCR5- CD8+ T細胞，CXCR5+ CD8+ T細胞表面表達低水平的抑制受體PD-1和Tim-3，具有更強的細胞毒性，在慢性感染中發揮重要的限制作用。對於這類新亞群細胞的分化發生，研究人員發現Id2/E2A信號通路是CXCR5+ CD8+ T細胞所必須的。重要的是，在HIV患者中，研究人員也發現了病毒特異性的CXCR5+ CD8+ T細胞亞群的存在，病人中CXCR5+ CD8+ T細胞數量與HIV病毒量呈負相關。通過一定的手段，增加和穩定這一類CD8+ T細胞可以增強其清除病毒的功能，這為從根本上治癒這些疾病提供了新可能。

8

北生所新發現為乙肝治療帶來新希望

2016年10月26日，乙肝病毒受體發現者、北京生命科學研究所李文輝研究員率領研究團隊在乙肝病毒的cccDNA合成的分子機制方面有了重大發現，相關研究成果在線發表在《PLoS Pathogens》期刊上「DNA Polymerase κ Is a Key Cellular Factor forthe Formation of Covalently Closed Circular DNA of Hepatitis B Virus」，該研究發現為乙肝治療帶來了新的方向。

HBV的rcDNA雙鏈長短不一，長鏈（L）完整，為負鏈，短鏈（S）為正鏈，不完整，長度隨機可變。HBV經NTCP受體進入肝細胞後，HBV rcDNA進入細胞核，短鏈會進行擴增延長，「填充缺口」形成cccDNA (cccDNA從頭合成過程)，後者作為模板指導病毒mRNA和pgRNA合成，pgRNA在胞質中與病毒DNA聚合酶結合，並被衣殼蛋白包裝形成核衣殼，pgRNA逆轉錄合成rcDNA，新合成的rcDNA可進入細胞核再次生成cccDNA (cccDNA複製過程)。因此cccDNA的形成和擴增是HBV建立持續慢性感染的基礎。因為cccDNA的形成涉及DNA鏈的延伸，人們推測細胞內參與DNA修復的某些酶催化了cccDNA的合成，但是相關研究所獲甚微。

研究人員首先構建了突變病毒HBV-ΔHBc，該病毒無法產生衣殼蛋白故而無法進行病毒DNA的複製。在添加病毒DNA聚合酶抑制劑下，通過突變病毒與正常病毒感染HepG2-NTCP後合成的cccDNA對比，證明病毒DNA聚合酶並不參與cccDNA從頭合成過程，說明了細胞DNA聚合酶參與的可能。在哺乳細胞中共有15種DNA聚合酶，究竟是哪種酶參與了cccDNA從頭合成過程呢？研究人員利用siRNA進行功能篩選，發現了三種細胞DNA聚合酶POLK, POLL和POLH是病毒cccDNA從頭合成所必須的，其中POLK最為重要。後續的CRISPR敲除和外源回復表達實驗都進一步驗證了實驗結果。該研究首次發現了HBV通過劫持細胞DNA聚合酶來實現cccDNA的從頭合成過程，這一研究發現為乙肝的治療帶來了新的治療方向，開發以POLK為靶點的抗HBV藥物具有一定的前景。

9

中國科學家發現Zika病毒或導致雄性小鼠不育！

2016年11月21日，中國科學院微生物研究所研究員、中科院院士高福團隊和中國農業大學教授李向東課題組合作在《Cell》期刊在線發表一篇題為「Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility inMice」的文章，揭示Zika病毒（ZIKV）會損害雄性小鼠睾丸組織，導致不育問題。這一研究從新的角度揭示了Zika病毒對生殖健康的影響，或將引起新的關注。

自2015年初在巴西爆發以來，Zika病毒因會導致新生兒「小頭症」迅速成為國際高度關注的突發公共衛生事件。過去已有研究證實，Zika病毒會在精液中存留數月，但是它對於男性生殖健康的影響一直尚未明確。為了解開謎團，高福院士和李向東教授帶領團隊以雄性小鼠為模型，通過分析它們的睾丸、附睾、前列腺、精囊等組織解析Zika病毒的感染模式。結果顯示，感染了病毒的小鼠，即便血液檢測正常，研究人員依然在其睾丸組織中檢測到殘留的病毒，這意味著Zika病毒突破了血-睾屏障。Zika病毒並不會感染前列腺和精囊，但會引發睾丸間質、支持細胞和附睾上皮細胞啟動免疫反應，生成大量促炎性細胞因子/趨化因子。然而，Zika病毒並不會引發管周肌樣細胞和精原細胞大量合成細胞因子，這意味著，這兩類具有幹細胞特性的細胞比較脆弱，容易受到Zika病毒感染，從而導致睾丸受損。研究人員推測，管周肌樣細胞和精原細胞很可能就是Zika潛伏的病毒庫。研究人員希望，國際醫學界和公共衛生政策制定機構對Zika病毒對生殖健康的風險予以高度重視，特別是對現存精子庫的新檢測和臨床上Zika病毒感染過的男性的長期隨訪。

10

中國疾病預防控制中心重大發現，「RNA病毒圈」或被重新界定

2016年11月23日，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所張永振研究員領銜的科研團隊通過合作研究在病毒起源和進化的研究中取得重大突破——該團隊發現了1445種全新的病毒科，極大豐富了RNA病毒的多樣性，並從遺傳進化的角度揭示了RNA病毒發生和進化上的基本規律，其中一些病毒與現有已知病毒的差異性之大，以至於需要重新被定義為新的病毒科，相關研究成果以「Redefining the invertebrate RNA virosphere」為題發表於《Nature》雜誌上。

根據國際病毒分類委員會的統計，目前已確認的DNA病毒和RNA病毒共有2284種。在長達5年的科研攻關中，該團隊針對9個動物門、超過220種無脊椎動物標本進行了宏轉錄組測序，這種測序是以特定樣品中微生物群落的全部RNA為研究對象，從轉錄水平上分析微生物群落中活躍菌種的組成及其相關情況。新發現的這些病毒填補了RNA病毒進化上的主要空缺，並揭示了一個以宿主轉換和共進化為特徵的病毒進化史。總的來說，這些數據呈現了一個比目前的分類系統所描繪的親緣進化關係更複雜且基因組多樣性更豐富的病毒圈，從而為病毒的生態和進化研究提供了更堅實的基礎。同時，這項突破也改變了病毒學的傳統觀念，為認識生命的起源進化提供了新的基礎。

11

北京大學藥學院在病毒疫苗領域做出重大突破

2016年12月2日，《Science》上發表了北京大學藥學院周德敏教授課題組關於病毒免疫疫苗的突破性研究成果，論文題為「Generation of Influenza A Viruses as Live butReplication-Incompetent Virus Vaccines」。該項研究以流感病毒為研究模型，發明了一種全新的人工控制病毒複製從而將病毒由致命性傳染源變為預防性疫苗的技術，這一技術突破了現有的疫苗設計手段，開創了新的病毒疫苗設計體系，是病毒疫苗研發領域的一項重大突破，意義巨大。

該項研究工作中利用了MbpylRS/tRNACUA與UAA（unnatural amino acid）聯合使用的翻譯系統。該翻譯系統在普通細胞中不存在，作者利用琥珀密碼子（終止密碼子）可以識別非天然氨基酸的原理進行的人為改造，產生表達該翻譯系統的轉基因細胞。在表達該翻譯系統的293T細胞中，當DNA序列上出現TAG的終止密碼子時，在細胞中添加UAA的情況下，蛋白翻譯不會終止。作者將病毒複製基因（NP，PB1，PB2，PA）的某個編碼密碼子突變成TAG終止密碼子，當這些基因轉染改造的293T細胞（transgenic cell）的時候，由於細胞可以翻譯TAG終止密碼而正常產生新病毒。

通過這種突變的方式獲得的病毒活性疫苗的免疫作用有多強呢？作者分別用對照（vehicle），終止密碼子突變毒苗（PTC-4A）和臨床應用的滅活（IIA）和減活（CAIV）疫苗做了比較，發現終止密碼子突變毒苗的效果與減活毒苗CAIV的效果相當。此外，當終止密碼子突變病毒與野生型病毒同時感染細胞時，野生型病毒的複製能力反而下降；下降程度與野生型病毒和突變病毒的配比有關，同時與終止密碼子引入的數量有關。通過進一步的測序證明，這是由於野生病毒與突變病毒之間發生了重組（genetic reassortment），導致產生的子代病毒中至少有一個複製缺陷的突變基因片段，使得子代病毒也出現複製缺陷。這說明多終止密碼突變的病毒還具有一定的治療作用。這一文章以流感病毒為例從理論上證實了製備免疫力更強，免疫譜更廣泛的無複製能力活病毒疫苗是可行的。

12

科學家從中國病人體內分離出寨卡病毒人源治療性抗體

中國科學院微生物研究所、中國疾病預防控制中心高福院士，中國科學院微生物研究所嚴景華研究員領導的研究團隊，於2016年12月14日在國際權威學術刊物《Science Translational Medicine》以封面文章形式發表題為「Moleculardeterminants of human neutralizing antibodies isolated from a patient infectedwith Zika virus」的學術論文。報道了從中國寨卡康復病人體內鑒定出高效、特異的寨卡病毒單克隆抗體，該研究為防治Zika病毒提供了重要的抗體藥物支撐。

本研究建立的B細胞單細胞PCR-測序技術，能夠從康復者B細胞中快速分離鑒定出抗原特異的中和抗體，短時間內達到規模化生產，從而提供大量有效的應急抗體。研究人員從我國首例在委內瑞拉感染寨卡病毒並康復的江西患者體內提取出13株全人源抗體進行一系列動物和細胞實驗，結果表明其中3株抗體具有高中和活性，在小鼠模型上能有效治療寨卡病毒感染，有望成為治療寨卡病毒感染的候選藥物。隨後通過結構生物學手段對三株人源抗體的中和機制進行解析，清楚地知道保護性抗體的結合位點及中和機制，這在全球尚屬首次。此次3株高活性中和抗體中有兩株（Z23和ZL1）屬於阻斷寨卡病毒感染的特異性抗體，它們對登革熱等黃病毒沒有交叉反應，有望進一步開發成治療寨卡的特效藥物，相關臨床前研究正在進行。

歡迎大家下方留言繼續補充，寫下讓您振奮的重大研究發現。

中國病毒學論壇面向全球華人病毒學家徵稿，

竭誠歡迎最新病毒學領域進展投稿，

中國病毒學論壇資源入口：

微信公眾號：中國病毒學論壇

Journal of Applied Virology期刊：www.biosky.org/jav/index.php/jav

請勿重複加群，資源留給更多人，否則一律清理！

撰文：ipsvirus

本期編輯：Tony