清華楊茂君課題組Cell發表突破性研究成果

北京時間12月2日凌晨，國際學術期刊Cell在線發表了清華大學楊茂君課題組題為《哺乳動物呼吸鏈超級複合物I1III2IV1結構》（Structure of mammalian respiratory supercomplexI1III2IV1）的研究論文，首次獲得了豬心呼吸鏈超級複合物4.0 ?解析度下的冷凍電鏡結構，其中複合物Ⅰ和複合物III更是達到了原子解析度（3.6 ?）。

論文解讀

撰文丨Andy

有氧呼吸是動物和植物進行呼吸作用的主要形式，指的是細胞在氧的參與下，通過多種酶的催化作用將糖類等有機物徹底氧化分解，產生出二氧化碳和水，同時釋放大量能量的過程。細胞內的能量物質轉換髮生在線粒體中，因此線粒體是為細胞提供能量的「動力工廠」。其氧化過程由線粒體內膜上的4個呼吸鏈膜蛋白複合物(簡稱複合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和IV)來完成。在多種低等生物中，多亞基的複合物Ⅰ可被一類單一組分的Ⅱ型NADH氧化還原酶型（NDH2）所替代。NDH2以FAD為輔基，催化電子由NADH傳遞到輔酶Q，完成了電子傳遞鏈的第一步反應。

線粒體複合物結構生物學的研究有助於徹底闡釋這些複合物的電子傳遞機制以及跨膜質子泵的工作原理，並可為細胞呼吸相關的疾病（如老年痴呆症、帕金森綜合征和多發性硬化症等）的治療提供重要的靶位信息。因此，線粒體複合物的結構一直是結構生物學研究領域研究的焦點。

線粒體複合物結構生物學領域的重要進展出現在1995年，Tsukihara等首次獲得了牛心複合物IV晶體的衍射數據，電子密度圖清楚地顯示了各個金屬結合中心【1】（同年，Iwata等在Science上發表了脫氮副球菌複合物IV部分亞基的晶體結構【2】）。一年後，Tsukihara等報道了基於這套數據解析的牛心線粒體複合物IV完整的13亞基的晶體結構【3】。基於晶體結構，研究人員闡明了複合物IV內部的電子傳遞路線。

1997年，Xia等在Science上首先報道了牛心線粒體複合物Ⅲ的在2.9?解析度下的部分結構【4】。1998年Iwata等確定了牛心線粒體複合物Ⅲ11個亞基的完整晶體結構【5】。基於這一重要結構以及來自於Zhang等【6】的重要貢獻，線粒體複合物Ⅲ內部的電子傳遞機製得以闡明。

2005年，饒子和院士課題組的孫飛等在世界上首次報道了由四種不同蛋白質組成的複雜的豬心線粒體複合物Ⅱ的精細三維結構【7】。該複合物尾部分布了5個帶電的氨基酸和兩個極性的氨基酸，由此確定了複合物Ⅱ是一個跨膜蛋白質複合物，而不是一個外周膜蛋白。同時進一步驗證了電子傳遞體的氧化還原電位是受其周圍的氨基酸環境調控的。這是線粒體呼吸鏈研究領域中一個里程碑式的發現，填補了線粒體結構生物學和細胞生物學領域中的一個空白。這一研究成果發表在Cell上，是Cell1980年來首次完整地刊登中國科學家在本土完成的完整系統原創性研究成果（Cell雜誌主編在剛過去的世界生命科學大會的報告中特地展示了這篇文章，可見這篇文章的意義確實非同一般，見下圖）。這一研究成果還被寫入翟中和院士等主編的《細胞生物學》等教科書中。需要指出的是，複合物Ⅱ的原核版本是在 2003年被 Yankovskaya 等解析的，結果發表在Science上【8】。

2010年，Hunte等首次確定了由40多個不同的蛋白質組成的酵母線粒體複合物Ⅰ較低解析度的晶體結構（6.3 ?）。2015年，同一課題組（Brandt）又將解析度提高到了3.9?。對於細菌呼吸鏈複合物Ⅰ來說，Sazanov等在2006年解析了8亞基的嗜熱菌複合物Ⅰ的親水結構域【11】。獨立後的Sazanov領導的研究組先後報道了嗜熱菌的完整複合物Ⅰ較低解析度的晶體結構（4.5?）【12】、大腸桿菌複合物Ⅰ跨膜結構域3.0?的晶體結構（缺NuoH）【13】和嗜熱菌複合物I較高解析度的真正完整的晶體結構（3.3??）【14】，至此終於闡明了這一已知最大膜蛋白複合物的整體結構和作用機制。

理論上，生物大分子的結構解析主要有X-射線衍射、核磁共振和冷凍電鏡三種技術手段。而實際上，冷凍電鏡的解析度在相當長的一段時間內一直無法與X射線晶體學相提並論，甚至一度被嘲笑為「blob-ology」。但是近幾年，冷凍電鏡領域取得了革命性突破，一個原因是直接電子探測器的發明和應用，另一個是高解析度圖像處理演算法的改進（Relion程序），使得單顆粒冷凍電鏡現在可以較為輕鬆地解析300kDa以上的非對稱性蛋白複合物近原子或原子解析度的結構，用這種方法獲得的最高解析度已經達到了驚人的1.8?，分子量亦達到了93kDa。毫無疑問，冷凍電鏡正在超越其它一切技術手段，越來越成為大多數結構生物學家們的第一選擇。

2016年8月10日，Zhu等在Nature上在線發表了牛線粒體複合物I4.2?的冷凍電鏡結構【15】；9月5月，Sazanov課題組的Fiedorczuk等在Nature上在線發表了完整綿陽線粒體複合物I3.9?【16】的冷凍電鏡結構。這兩個哺乳動物線粒體複合物I的結構（特別是後者）為該複合物的作用機制、組裝、成熟和功能失調提供了重要間接，允許對引起疾病的突變進行詳細的分子層面上的分析。

楊茂君課題組早在2012年就解析了首次II-型線粒體複合物I NDH2家族成員的典型代表——釀酒酵母Ndi1處於無底物、NADH結合狀態、泛醌（UQ）結合狀態和NADH-泛醌（NADH-UQ）結合狀態四種狀態下的晶體結構【17】，全面揭示了Ndi1的調控及其介導電子傳遞的詳細機制，並為針對NDH2的藥物設計以及更好地將Ndi1應用於基因治療奠定了良好的基礎。

2000年，研究人員發現線粒體複合物並不是完全獨立存在的，而是相互結合形成更高級的組織形式——呼吸鏈超級複合物【18】。後續的研究發現，單獨的呼吸鏈複合物之間通過不同的組合方式相互結合，可以形成多種類型的超級複合物，其中具有完整呼吸活性的超級複合物又被稱作呼吸體。哺乳動物中丰度最高、最為重要的呼吸體是由1個複合物I，1個複合物III的二聚體和1個複合物IV組成的，即I1III2IV1。

2016年9月21日，楊茂君課題組在Nature上在線發表了豬心呼吸體的冷凍電鏡結構（5.4??），該結構為哺乳動物呼吸鏈複合物在線粒體上的精確的組織形式和分子機理的闡釋提供了重要的信息。這一結構也是迄今為止世界上所解析的最大也是最複雜的不對稱性膜蛋白超級複合物。同一天， Sazanov 課題組也在Nature上在線發表了綿羊線粒體呼吸鏈超級複合物的低解析度的電鏡結構【19】。 鑒於解析度的限制，超級複合物的精確的組織形式在很大程度上仍然未知，進而使得各電子在呼吸鏈複合物之間的傳遞詳情仍不是很確定。

在這一最新的 Cell 文章中，楊茂君課題組在前期工作的基礎上，進一步將解析度提高到了近原子解析度的 4.0 ?。結構顯示，複合物 III 二聚體和複合物 IV 結合在 L-形複合物 I的同一側。 四個複合物 I 的附屬亞基——NDUFA11， NDUFB4， NDUFB8 和 NDUFB9 直接貢獻了複合物 I、 III 和 IV 的寡聚形式。複合物 IV 的 COX7C 和 COX7A 亞基將複合物 IV附著到複合物 III 和複合物 I 膜臂遠端形成的凹面處，值得注意的是磷脂分子接到了超級複合物的排列。 之前的 Q 模型指出 UQ 和 UQH2 可以分別結合到 Qi和 Qo位點，並且一個循環只能是一個 UQH2 的電子能被傳遞到細胞色素 C。該結構更傾向於支持另一個電子傳遞模型，在這個模型中，從複合物 I 中擴散出來的 UQH2僅僅能結合到 Qi位點，並可以一次將兩個電子傳遞給兩個細胞色素 C 蛋白。這一近原子解析度的結構確定了呼吸鏈超級複合物的精確的組織形式，揭示了蛋白蛋白和蛋白輔因子之間精緻的相互作用，指出了一個電子從NADH 傳遞到細胞色素 C 的可能的機制， 為整體上深度理解氧化磷酸化系統鋪平了道路，同時也為治療細胞呼吸相關的疾病奠定了重要的結構基礎。這一哺乳動物線粒體呼吸鏈超級複合物結構的解析無疑是當今結構生物學發展歷史上的一個重要里程碑。

參考文獻：

1.Tsukihara T, et al. (1995) Structures of metal sites of oxidized bovine heart cytochromec oxidase at 2.8 A. Science 269(5227):1069-1074.

2.Iwata S, Ostermeier C, Ludwig B, & Michel H (1995) Structure at 2.8 A resolutionof cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans. Nature376(6542):660-669.

3.Tsukihara T, et al. (1996) The whole structure of the 13-subunit oxidized cytochrome coxidase at 2.8 A. Science 272(5265):1136-1144.

4.Xia D, et al. (1997) Crystal structure of the cytochrome bc1 complex from bovineheart mitochondria. Science 277(5322):60-66.

5.Iwata S, et al. (1998) Complete structure of the 11-subunit bovine mitochondrialcytochrome bc1 complex. Science 281(5373):64-71.

6.Zhang Z, et al. (1998) Electron transfer by domain movement in cytochrome bc1. Nature392(6677):677-684.

7.Sun F, et al. (2005) Crystal structure of mitochondrial respiratory membraneprotein complex II. Cell 121(7):1043-1057.

8.Yankovskaya V, et al. (2003) Architecture of succinate dehydrogenase and reactive oxygenspecies generation. Science 299(5607):700-704.

9.Hunte C, Zickermann V, & Brandt U (2010) Functional modules and structural basisof conformational coupling in mitochondrial complex I. Science329(5990):448-451.

10.Zickermann V, et al. (2015) Structural biology. Mechanistic insight from the crystalstructure of mitochondrial complex I. Science 347(6217):44-49.

11.Sazanov LA & Hinchliffe P (2006) Structure of the hydrophilic domain of respiratorycomplex I from Thermus thermophilus. Science 311(5766):1430-1436.

12.Efremov RG, Baradaran R, & Sazanov LA (2010) The architecture of respiratorycomplex I. Nature 465(7297):441-445.

13.Efremov RG & Sazanov LA (2011) Structure of the membrane domain of respiratorycomplex I. Nature 476(7361):414-420.

14.Baradaran R, Berrisford JM, Minhas GS, & Sazanov LA (2013) Crystal structure of theentire respiratory complex I. Nature 494(7438):443-448.

15.Zhu J, Vinothkumar KR, & Hirst J (2016) Structure of mammalian respiratorycomplex I. Nature 536(7616):354-358.

16.Fiedorczuk K, et al. (2016) Atomic structure of the entire mammalian mitochondrial complexI. Nature 538(7625):406-410.

17.Feng Y, et al. (2012) Structural insight into the type-II mitochondrial NADHdehydrogenases. Nature 491(7424):478-482.

18.Schagger H & Pfeiffer K (2000) Supercomplexes in the respiratory chains of yeast andmammalian mitochondria. The EMBO journal 19(8):1777-1783.

19.Letts JA, Fiedorczuk K, & Sazanov LA (2016) The architecture of respiratorysupercomplexes. Nature 537(7622):644-648.

楊茂君教授簡介

楊茂君，1975年出生於山東省泰安市；1999年畢業於吉林大學生命科學學院，並於2003年於中國協和醫科大學獲博士學位師（從師從王琳芳院士，2001年10月進入清華大學饒子和院士實驗室從事SARS蛋白酶晶體結構方面的研究），後加入美國西南醫學中心從事博士後研究。2008年特聘為清華大學生命科學學院特別研究員、博士生導師；2011年受聘為清華-北大生命科學聯合中心研究員；2013年通過tenure track系列考核，成為清華大學首批tenure系列終身教授。在攻讀博士學位期間發表第一作者論文6篇，並於2003年非典肆虐的時候首次解析了SARS主要蛋白酶及其與抑制劑複合物的晶體結構，為抗SARS藥物的研發奠定了重要的結構基礎。在美國從事博士後研究期間，在Cell、Molecular Cell和NSMB等雜誌上發表細胞周期檢查點調控相關的第一作者論文6篇。回國以來，楊茂君教授一直致力於綜合運用結構生物學、生化與分子生物學等方法，研究與人類健康密切相關的重大疾病的發病機理及特異性抑制劑的篩選與設計，在細胞感應外界信號以及物質跨膜轉運、蛋白質翻譯後修飾調控兩方面取得了一系列重大研究成果，已先後在Nature、Science、Molecula Cell、Genes &Development、PNAS和Cell research等國際權威期刊發表SCI通訊作者論文21篇。此外，楊茂君教授曾獲得多項榮譽與獎勵，包括霍英東基礎研究獎勵、教育部新世紀優秀人才支持計劃、茅以升北京青年科技獎、葯明康德生命化學研究獎、談家楨生命科學創新獎和國家傑出青年基金等。人才培養方面，實驗室培養的所有博士研究生畢業時均獲得了清華大學或清華-北大生命聯合中心優秀畢業生。其中第一個博士生畢業後被直接特聘為北京化工大學副教授；三人次獲得北京市優秀畢業生稱號；六人次獲得國家獎學金獎勵。

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