笹井芳樹：培養皿中長出視網膜
科學家已經可以誘導>形成視網膜，這為很多眼疾患者帶來希望。
在子宮裡，一團相同的細胞分化成各種不同的模樣，最終形成高度有序的結構，組裝成人體的全副器官。這個過程依照內在的「生物學藍圖」有條不紊地進行，引導組織產生摺疊、皺褶，精確形成適當的外形和大小。
科學家很熟悉這個由簡單到複雜的進程，他們一直在思索胚胎髮育的機制，暗自驚嘆它的奧妙，又渴望在實驗台上重演早期發育階段——既為了更好地理解其中的生物學機制，也為了將這些信息應用於修復和替代受損組織。這個時刻或許已到來了。解密發育奧妙的工作最近取得了不少成就，體外培養的替代器官有望在10年內就進入手術室。
我之所以作出如此樂觀的預測，是因為我的實驗室近來在幹細胞研究上取得了一些成果。幹細胞會分化成其他類型的細胞。我們發現，即使在體外培養的環境下，幹細胞也可以分化形成視網膜——眼睛裡的關鍵結構之一，它把來自外部世界的光信號，轉換成電信號和化學信號，繼而傳遞給大腦的其他部位。
此外，我和同事還培植出了皮層組織，以及垂體的一部分。由於我們對人體信號傳導系統的認識越來越深入，因此在做上述研究時，我們根據自己掌握的知識，對培養皿中的一層相互分離的細胞進行誘導，讓它們形成了一種輪廓分明的三維結構。其實，這些細胞收到我們「輸入」的化學信號後，自己就會行動起來，開始建造視網膜。這一研究成果讓很多人看到了希望：用這種方法製備的視網膜組織有望用於治療黃斑變性等多種眼疾。
培養皿中的奇蹟
剛開始嘗試「培養」視網膜時，我們實驗室還在探討視網膜形成的一些基本問題。我們知道，視網膜是從胎兒大腦中名為「間腦」（diencephalon）的那一部分發育而來的。在胚胎髮育的早期階段，間腦的一部分會擴展，形成氣球狀的視泡（optic vesicle），後者再向內凹陷，形成視杯；視杯進一步形變，最終成為視網膜。
一個多世紀以來，生物學家一直就視杯形成的精確機制爭論不休，直到今天，研究大腦發育的科學家仍然各執一詞。其中一個較有爭議的問題是，在視杯形成過程中，與之相鄰的一些結構，如晶狀體和角膜起了什麼作用？有些科學家認為，視網膜向內凹陷，是因為受到了晶狀體的物理推動作用；也有科學家認為，視杯無須藉助晶狀體的作用，就可以自己形成。
要想在活著的、正在發育中的動物身上觀察這一現象絕非易事，因此大約在10年前，我的研究團隊決定做一次嘗試，看能不能把眼睛的發育過程「提取」出來。
具體做法是，先在培養皿中培養胚胎幹細胞，然後加入眼睛發育所需的化學物質，觀察培養皿中發生的情況。從發育程度上來說，胚胎幹細胞是最原始的幹細胞，最終可以分化成從神經到肌肉的各種組織。
當時，把幹細胞培育成器官的技術尚不存在。人們曾把相互分離的幹細胞「撒」在膀胱或食管形狀的人工骨架上，試圖搭建出新的器官。這類組織工程學技術在培植真實器官方面並不是很成功。
因此，我們決定另闢蹊徑。在正式動手之前，我們做了一些準備工作。2000年，我們發明了一種細胞培養方法，可以把小鼠的胚胎幹細胞轉變成多種神經細胞。隨後，我們在培養皿中培養了一層小鼠胚胎幹細胞，並加入一些可充當「傳遞員」的細胞——這些細胞會向胚胎幹細胞傳遞化學信號，促使後者發育、分化，脫離胚胎狀態。
我們培養這些細胞的目的，並不是要複製某個人體器官的三維結構，而是想看看，僅用細胞自身的化學信號，是否足以讓胚胎幹細胞形成眼睛發育早期所獨有的神經細胞。
起初，我們沒有獲得多大的成功，但在2005年，我們在技術上取得了突破。以前，我們實驗室在培養幹細胞時，細胞只能平鋪在培養皿上，但在2005年，我們突破了「二維限制」，可以讓幹細胞懸浮在培養液中，這就是「懸浮培養」。
我們採用這種三維培養技術的原因有很多。首先，在懸浮培養中，細胞聚集時，本身就會形成三維結構，因此在產生複雜組織時，會比平鋪的細胞層更容易；其次，為了發育成複雜的結構，細胞之間需要相互交流，而三維培養更適於促進這樣的交流，因為細胞之間可以更加靈活地發生相互作用。
使用這種新方法，我們把相互分離的胚胎幹細胞懸浮在液體培養基中，然後注入多孔培養皿的小孔中（每個小孔只有微量的培養基，含大約3 000個胚胎幹細胞）。我們發現，原本分開的胚胎幹細胞開始聚集在一起。
隨後，就可以誘導這些微小的細胞聚集體，讓它們全部分化為一種神經前體細胞（neural progenitor）——這類細胞通常存在於大腦前部。然後，這些細胞開始相互發送信號，經過三四天的時間，它們便自發組織成中空的球體，由單層的神經上皮細胞構成（神經上皮細胞即神經幹細胞，由前體細胞分化而來）。我們把這種形成單細胞層的方法稱作SFEBq培養法，即「胚狀體樣聚集體的快速再聚集無血清懸浮培養法」（serum-free floating culture of embryoid body-like aggregate with quick reaggregation）。
在胚胎中，神經上皮細胞接收來自細胞外的化學信號，最終形成特異的大腦組織結構。在這些化學信號中，有一種信號可觸發間腦的發育，形成視網膜和下丘腦（hypothalamus，控制食慾和其他許多基本生理功能的腦區）。
成功地使胚胎幹細胞形成球體之後，我們實驗室開始嘗試，誘導這些細胞分化成視網膜前體細胞——成熟視網膜細胞的前體。我們向SFEBq培養體系中加入了一系列蛋白質。在胚胎中，這些蛋白的作用正是誘導視網膜前體細胞的產生。
當這些細胞球體在懸浮培養基中繼續保存了數天之後，視網膜上皮組織自發地向外突出，形成視泡樣的結構。然後，突起部分的頂端又開始內陷，形成酒杯狀結構，很像胚胎上眼睛的視杯。與活體動物中一樣，這個源自胚胎幹細胞的視杯也由內外兩層組成：外壁是上皮層，內壁便是視網膜。
換句話說，在培養皿中，原本分開的幹細胞組成的聚集體，獨自形成了有序的結構——真是名副其實的「eyepopping」（這個詞有雙關含義，從字面上理解，就是「眼睛出現」，而這個詞本身的含義是「使人瞠目的」）。
不像在胚胎中，培養皿中並沒有晶狀體和角膜。這一發現清楚地回答了那個存在已久的問題：原始視網膜的形成，是否需要晶狀體等鄰近組織施加外部作用力。至少在體外，視網膜的形成是一個基於細胞內部程序的自發現象。
眼睛的形成
由一小塊胚胎組織發育成眼睛，會經歷如下步驟：內部的神經上皮層向外凸起，形成視泡（第9天）；凸起部分的外層向內凹陷（第9.5天），晶狀體泡隨之形成（第10天）；視泡的一部分發生摺疊，形成視杯，與晶狀體泡共同形成視網膜、視神經及最外部的晶狀體（第10.5天）。視網膜包括三個不同的細胞層：視桿和視錐細胞；水平、雙極和無長突細胞；視神經節細胞。
眼睛發育的再現
培養皿中，眼睛的發育過程繼續進行著，就像我們在胚胎髮育中所看到的一樣。我們讓視杯在懸浮培養體系中又呆了兩個星期，組織的直徑大約長到了2毫米，而且與胚胎中一樣，單層的視網膜上皮也演變成了層級結構，含有所有6種可在初生嬰兒的眼睛中檢測到的細胞。
這一層級結構的外層是光感受器細胞層，最內層是神經節細胞，這類細胞在機體中的作用是連接視網膜與大腦。如同你在真實視網膜中看到的一樣，在內外兩層之間是幾層連接層，由中間神經元（interneuron）構成。與此前一樣，多層結構的出現也是依照內在程序完成，這個程序會決定什麼細胞應該產生，它們又應該被安排在三維空間的什麼位置。
我們的工作仍未結束。視杯究竟如何形成，一團細胞究竟如何出現規整的結構，這些問題仍然存在。由同一物質構成的團塊自發產生複雜形狀，這一過程叫做對稱破缺（symmetry breaking），貫穿整個胚胎髮育過程。如果沒有對稱破缺，受精卵重複進行細胞分裂只會產生一團未分化的細胞，發育過程會止步不前。我們的自組織胚胎幹細胞培養體系似乎可以作為一個理想的實驗平台，來研究哺乳動物胚胎形成過程中的這些玄妙機制。
另一個還不清楚的問題是，單層的視網膜上皮到底是怎麼演變成視杯形狀的。總的來說，機械力和組織的剛性控制著上皮組織的形變。通過在體外測定視杯形成過程中上皮不同部分的受力方向和組織剛性，我們發現，形成這一結構需要三個步驟。
在這一過程中，視網膜的剛性減弱，柔韌性增加；同時，視網膜與上皮交界處的細胞變成楔形；最後，視網膜因快速擴展而內陷。這三個步驟對視杯的形成至關重要。實際上，當我們把這些與組織的機械性質有關的條件輸入計算機模擬程序後，的確出現了我們熟悉的酒杯形狀。
培養皿中的眼睛
在培養皿中，誘導胚胎幹細胞形成視網膜的過程，扼要地再現了胚胎中眼睛發育的主要步驟。這項技術對基礎研究的價值不可估量，同時有助於開發一些療法，幫助視力減退的患者恢復視力。如下圖所示，在加入名為生長因子的分子之後，胚胎幹細胞開始聚集；大約5天後，開始形成最原始的視泡。及至第7天，視泡向外凸出；幾天後，該結構內陷，形成視杯；到第24天，視網膜的所有層次初具雛形。
應用前景
聽說我們的研究後，人們自然想知道，用小鼠胚胎幹細胞所做的工作究竟能否給眼疾患者帶來好處。在這個方向上，我們已取得了一些進展。值得一提的是，我的實驗室最近剛剛在一篇文章中報道過，我們成功地使人類胚胎幹細胞分化成視杯和多層神經組織。
我們預計，同樣的培養方法也可應用於人類的誘導多能幹細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）——成熟細胞受到特定刺激後，經過逆轉的發育過程，可成為誘導多能幹細胞，其行為與胚胎幹細胞相似。我們還發明了更好的低溫貯存方法，能在液氮中儲存由人類胚胎細胞分化成的視網膜組織。
這些工作都將推動體外培養的視網膜組織應用於醫學。例如，我們可以製造人工視網膜，幫助人們研究常見眼部疾病的病理機制，推動新葯和基因療法的研究，逆轉視網膜病變。
全世界有數百萬人患有黃斑變性、視網膜色素變性（retinitis pigmentosa）和青光眼（glaucoma），這三種視網膜退行性疾病的患者也許都可以從我們的研究中獲益。三種疾病中，發生病變的視網膜細胞層各不相同。
在黃斑變性中，由於支撐組織「崩潰」，視網膜上皮的完整性受到影響，光感受器細胞也發生退化，尤其是視網膜中心區域。
在視網膜色素變性中，視桿細胞（rod，光感受器細胞的一種）數量一年年逐漸減少，最初也是最常見的癥狀是「夜盲」，而後來，患者會喪失大部分視野，只剩下一小塊中心視野。
在青光眼病例中，受損的則是神經節細胞，這類細胞會伸出視神經，把視網膜與大腦後部皮層上的視覺處理中心連接起來。
黃斑變性可能是這三種疾病中最容易用細胞替代療法緩解的一種。使用傳統培養方法和我們的新方法，人類胚胎幹細胞和誘導多能幹細胞都比較容易產生支撐組織的細胞，即視網膜色素上皮細胞，並可從培養基中直接提取出來。
美國已開始用這種細胞進行早期小規模臨床實驗，其他國家也有類似的實驗計劃。在這些實驗中，研究人員會用細針，將幹細胞分化成的色素上皮細胞注射到色素上皮和光感受器細胞層之間，至少替代部分受損組織。
>色素變性的細胞療法尚需進一步改良才能應用於人類。與傳統培養方法不同，我們的新技術可產生一層密集的視桿細胞，適於進行移植，但移植了這種細胞層之後，還需用其他關鍵手段來提高視力。
光感受器細胞不同於簡單的上皮支撐組織，需要整合到眼睛的神經迴路中；尤其重要的是，光感受器需與另一種感覺細胞——雙極細胞——重新形成細胞連接，而我們尚不知道如何有效形成這種連接。若能成功移植光感受器細胞，將有望使視網膜色素變性患者至少恢復部分視力，甚至使晚期患者受益。
青光眼也許是這三種疾病中最難用細胞療法治療的。胚胎幹細胞培養固然能夠產生這種療法所需的神經節細胞，但胎兒出生後，視神經的再生長便會受到抑制。神經節細胞發出分支，形成視神經，向大腦傳遞信號，這些分支稱作軸突；迄今為止，人們還沒有發現誘導其軸突與其他細胞重新連接的方法。
比起現有的組織工程學技術，即將細胞安放到皮膚或膀胱形狀的骨架上，胚胎幹細胞分化成的組織顯然要好得多。作為研究者，我們必須謹慎而有耐心地揭示發育中的細胞所隱藏的奧秘——由單個細胞形成眼睛這樣的複雜器官，究竟經歷了怎樣複雜的過程。
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