Science報道北大周德敏課題組在病毒疫苗領域的重大突破——附特別點評

BioArt按：12月2日，Science發表了北京大學藥學院周德敏教授課題組關於病毒免疫疫苗的突破性研究成果，論文題為「Generation of Influenza A Viruses as Live but Replication-Incompetent Virus Vaccines」，該論文的唯一單位是北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，藥學院院長周德敏教授是該文的通訊作者，張和禮院士（周德敏教授博士期間的導師）是本文的作者之一。該項研究以流感病毒為研究模型，發明了一種全新的人工控制病毒複製從而將病毒由致命性傳染源變為預防性疫苗的技術，這一技術突破了現有的疫苗設計手段，開創了新的病毒疫苗設計體系，是病毒疫苗研發領域的一項重大突破，意義巨大。據北大藥學院官網介紹，該項研究引發了國內外多家主流媒體的廣泛報道。

撰文丨Goresco

一直以來，將具有生命威脅的病毒製備成無毒力活性疫苗都被看成是疫苗學的革命，因為在病毒疫苗製備中，都需要儘可能的削弱病毒的毒力，同時盡最大可能保留其感染力以維持免疫活性，但是滅火或者減活病毒疫苗常常表現出生產率低下和效能不足。北京大學周德敏教授實驗室的博士研究生司龍龍、徐歡以共同第一作者身份發表的Science文章以流感病毒為例從理論上證實製備免疫力更強，免疫譜更廣泛的無複製能力活病毒疫苗是可行的。

基本原理：

該項研究工作中利用了MbpylRS/tRNACUA（MS pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNACUApair）與UAA（unnatural amino acid：Ne-2-azidoethyloxycarbonyl-L-lysine）聯合使用的翻譯系統。該翻譯系統在普通細胞中不存在，作者利用琥珀密碼子（終止密碼子）可以識別非天然氨基酸的原理進行的人為改造，產生表達該翻譯系統的轉基因細胞。在表達該翻譯系統的293T細胞中，當DNA序列上出現TAG的終止密碼子時，在細胞中添加UAA的情況下，蛋白翻譯不會終止。作者將病毒複製基因（NP, nucleoprotein; PB1and PB2, polymerase basic proteins 1 and 2; PA, polymerase acidic protein）的某個或部分編碼密碼子突變成TAG終止密碼子，當這些病毒基因轉染普通293T細胞（conventional cell）的時候，由於蛋白翻譯過程中遇到終止密碼子導致病毒蛋白翻譯失敗，從而無法產生新病毒。當這些基因轉染改造的293T細胞（transgenic cell）的時候，由於細胞可以翻譯TAG終止密碼而正常產生新病毒。該研究工作的構建原理如下圖：

改造對病毒本身的影響：

由於在病毒基因組中引入的是終止密碼子，在transgenic cell中是用非天然氨基酸替代原有的氨基酸，那麼引入的氨基酸可能會影響病毒蛋白結構和功能，對病毒產生能力也可能造成影響，尤其是引入的突變位點較多的時候。同時由於病毒本身是具有高度突變能力的，那麼引入的終止密碼子有可能會被病毒逆轉有義密碼子而變成有複製能力的病毒。針對這些問題，作者實驗證實確實存在這樣的可能，並且進行了病毒生成能力和終止密碼子逃逸概率的統計。隨著突變位點的增多，病毒生產能力確實會受到影響。終止密碼子的逃逸概率與突變的具體位點有關，同時多位點終止密碼替換導致的逃逸率也下降。單位點終止密碼突變的概率在10-8，雙位點終止密碼突變的概率1.2x10-10，三位點終止密碼突變的逃逸概率小於10-11（難以檢測）。終止密碼子替換數量對產毒能力和逃逸概率的影響如下圖：

從安全性的角度考慮，用突變的辦法獲得的病毒如果作為疫苗使用，安全性和同類臨床應用的減活或滅活疫苗相比是類似的。至少從基礎研究層面的動物實驗（BALB/c小鼠鼻腔給疫苗的方式）結果看起來結果是非常理想的。如下圖：

從疫苗有效性角度考慮，通過這種突變的方式獲得的病毒活性疫苗的免疫作用對機體的保護作用有多強，作者分別用對照（vehicle），終止密碼子突變毒苗（PTC-4A）和臨床應用的滅活（IIA）和減活（CAIV）疫苗做了比較。採用疫苗免疫3周後，用同種野生型的流感病毒測試疫苗的保護作用，發現終止密碼子突變毒苗的效果與減活毒苗CAIV的效果相當。

由於流感具有高度可變性以及多種屬特點，突變毒苗（來源品系influenza A/WSN/33 (H1N1; WSN)）是一種全活病毒，是否對異種流感病毒有免疫保護作用？作者通過異種病毒（influenza A/reassortant/NYMC X-179A (pH1N1) or A/Aichi/2/68 (H3N2)病毒）做了異源免疫保護測試，發現對異種病毒（H1N1和H3N2）也具有較好的免疫作用。如下圖。這種免疫作用從文中給出的解釋來看，可能還是歸功於病毒蛋白的保守區域的原因。這個結果放在補充材料裡邊，可能是由於Science雜誌的篇幅限制。如果該實驗中能補足臨床在用的減活疫苗（CAIV）的對比作用會更好，從而能體現出這種突變疫苗相比減活疫苗的更強的免疫作用。也許作者做了，可能由於其他原因，未同時展示。

這樣的改造病毒疫苗具有提前免疫作用，那麼在使用的過程中，如果和野生型病毒同時存在於細胞內的時候，是否會放大疫苗的毒活性呢？因為野生型病毒是未突變的，具有完整的複製能力。實驗發現，終止密碼子突變病毒與野生型病毒同時感染細胞時，野生型病毒的複製能力反而下降；下降程度與野生型病毒和突變病毒的配比有關，同時與終止密碼子引入的數量有關。如下圖。通過進一步的測序證明，這是由於野生病毒與突變病毒之間發生了重組（genetic reassortment），導致產生的子代病毒中至少有一個複製缺陷的突變基因片段，使得子代病毒也出現複製缺陷。雖然作者未說明，這種現象可能與突變株產生的不完整蛋白與野生型病毒產生的完整蛋白之間的競爭作用，也會降低病毒的複製能力。這說明多終止密碼突變的病毒還具有中和已感染病毒的能力，甚至是治療作用。

BioArt評論：

如果通過這種突變的方式能廣泛的產生病毒疫苗，將極大的改善疫苗的製備，提高有效性和產率。這種策略甚至可以在一些病毒感染的危重病人中採用相對積極的臨床治療，比如HIV，Ebola等病毒感染者。如果有效，這種影響力將不亞於Car-T免疫靶向治療腫瘤。另外，由於涉及到轉基因，未來可能會考慮生物安全，這種突變會不會和人體的某些基因DNA序列之間發生重組，比如polymerase，如果會，也將可能是一個安全隱患。雖然有媒體報道的可能能作為國防生化安全的防禦性策略，但同樣亦可以成為生化安全的擔憂，不過這與科研本身是不同的層面。未來可能還有些研究工作可以繼續開展，比如利用大規模的測序，探測不同種或者同種不同亞系病毒的序列保守性，針對性的設計效果更好的病毒疫苗。以及和人體基因組之間的序列比較，選擇更低安全風險的策略。這項工作也讓我想到巴西在預防寨卡病毒時嘗試採用的策略，用攜帶致死基因的蚊子消滅蚊子來預防寨卡病毒的傳播。

Comments（匿名）：

周德敏教授課題組的這項工作意義重大，前文已經描述的非常清楚了，評論中不再贅述。這裡筆者想講講整個研究的最初的一些不為眾人所知的背景。周教授博後生涯（1999-2002）是在Scripps研究所Peter G. Schultz教授實驗室度過的，熟悉「遺傳密碼子拓展」領域的同行應該知道Peter教授是這個領域的權威，而周教授這篇Science的核心部分就是運用了這種改造密碼子翻譯技術，並將這種技術引入病毒體內改造病毒進而開創了新的病毒疫苗設計體系。Peter教授目前是Scripps研究所所長，他37歲當選美國科學院院士，38歲獲得沃夫化學獎並成為HHMI研究員，目前已經發表了近600篇研究論文，是化學生物學、合成生物學和材料生物學領域的頂尖級科學家，他在全球範圍內率先建立起了高通量小分子化學藥物篩選系統應用於生物學研究，除了周德敏教授之外，華人生物圈內還有多位知名科學家出自Peter教授實驗室，例如UCSF/現任清華藥學院首任院長的丁盛教授、北大化學分子與工程學院陳鵬教授、UCSF藥物化學系PI、Associate Professor王磊等。周教授這篇Science在Acknowledgments中提到了一個基金號「2016YFA0501500」，事實上這個基金號是一個國家重點研發計劃「蛋白質機器與生命過程調控」重點專項課題，首席科學家是北大陳鵬教授，實際上早在6年前，周德敏教授就主持了一個973項目——《基於基因密碼子擴展的蛋白質標記新方法》，其實這個973項目為如今這篇Science的工作奠定了堅實了基礎。總的來說，這項研究並不是一蹴而就的，它的背後有著周教授課題組多年來積累的經驗，在這些經驗之上然後把技術應用於病毒疫苗設計最終獲得成功，應該說這是基礎研究走嚮應用型研究的一個非常典型的例子，所以說在基礎研究方面國家投入大量的科研經費是非常有必要和值得的，希望今後國內能湧現出更多這樣基礎到應用轉化的世界一流成果。

孟頌東（中科院病原微生物與免疫國家重點實驗室）

周教授團隊的研究是一種「全新的、前所未有的方法」，為我們對抗病毒指明了新路。然而，他同時也表示了對這項研究近期用於臨床的擔憂。這種人工改造的病毒有可能發生意外的突變，打破原本對其自我複製性的限制，這將帶來不可估量的後果。此外，人造病毒和天然病毒重組後的結果可能並不像我們預期那樣好。孟頌東表示：「這項研究的風險在於改造後的病毒可能變得毒性更強，甚至複製更快。我認為，沒有任何國家的衛生部門，尤其是中國，會批准在病人體內接種活性病毒疫苗。」

附：周德敏教授簡介

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