「不老葯」的前世今生系列之 為你「鍾」情

初七，若通

［林奈花鐘］1751年博物學家林奈在《Philosophia Botanica》上首次提出了花鐘的概念，他發現許多植物都表現出近乎嚴格的生物節律，它們的開花和閉合在一天中有特定的時刻。蛇床花在凌晨三點悄然開放，黎明前有野薔薇吐露芬芳，午後陽光最烈的三點萬壽菊盛情綻放，入夜後夜來香和曇花帶來幽幽暗香。花鐘的指示花朵開花與閉合的時間有時受到季節和天氣的影響有一定的誤差，這是因為植物的生理鍾是由內在的節律循環以及外界環境信號的調節共同作用的。人體內也存在著同樣的以24小時為周期的生物鐘，外界環境是如何影響我們的生物鐘的，維持良好的生物節律又是如何影響我們的健康的呢？ 生物鐘的發現之旅生理節律（circadian rhythm）泛指生物體內存在的周期大約為24小時的生理生化過程，circadian 一詞來源於拉丁語，circa 是大約的意思，而diēm 在拉丁語中是一天的意思。這種由體內生物鐘基因所調控的，以24小時為周期的波動性生理過程廣泛存在於藍藻、酵母、植物以及動物體內。 公元前4世紀，亞歷山大大帝時期的一位船長注意到羅望子樹的樹葉在一天當中的移動是有規律性的，這是人類對於生物節律觀察的最早記載。而最早對於人的生理節律的記載可以追溯到公元13世紀，中國古代的中醫根據人身體機能在一天或季節中的狀態的波動性，選擇不同的穴位以及施針方式進行治療。1729年法國科學家Jean-Jacques d"Ortous de Mairan將含羞草置於恆定黑暗的環境下，發現含羞草葉片的活動仍能保持24小時的波動性變化，這是生物具有內源生物節律的最早證據。1918年，J.S. Szymanski發現動物也可以在沒有外界光和溫度等信號干擾時仍可以維持24小時的活動和睡眠節律。首個被鑒定的節律基因是上世紀70年代Ron Konopka 和 Seymour Benzer從果蠅中分離出來的「period」基因，其名稱代表了「周期」的含義。自此之後哺乳動物細胞內的節律相關基因與通路開始逐漸被一一發現和完善。

生物鐘與衰老研究的代表性事件

細胞內的精密「時鐘」及其影響因素

隨著細胞節律研究的深入，我們逐漸認識到：細胞內有一套複雜而精密的信號通路網路在調控細胞內各種生理生化反應的24小時周期性變化，而這個網路的核心調度中心則是一個由轉錄因子形成的負反饋系統，正因子CLOCK和BMAL1結合，激活轉錄負因子PERIOD（包括PER1，PER2，PER3；簡稱PER）和 CRYPTOCHROME（CRY1，CRY2；簡稱CRY）。當PER與CRY表達積累到一定程度時會結合在一起，反過來抑制CLOCK-BMAL1的活性，從而導致PER-CRY表達降低，形成每次循環約24小時的負反饋環路。這個核心負反饋系統里的轉錄因子可以直接或間接地調控細胞內超過10%的基因表達量的節律性波動，如NAMPT, SIRT, cyclin D, Wee等,參與細胞周期、細胞代謝以及DNA損傷修復等通路的調控，維持機體的穩態。

正因子以及負因子組成節律核心負反饋系統Albrecht, Urs, and J. A. Ripperger. Encyclopedia of Neuroscience 67.8(2009): 759-762.

除了細胞內核心的生物節律基因維持體內生物鐘的運轉，外界環境中的光照、溫度、濕度等信號，可以通過皮膚等感受器傳達到體內生物鐘的調控中心——視交叉上核(SCN)中，調節個體的生物節律。以光信號為例，2003年倫敦帝國學院醫學系以及霍華德－休斯醫學研究所的Foster和Yau團隊合作發現視黑素蛋白（Melanopsin）是自主感光神經節細胞(intrinsically photosensitive retinal ganglion cells, ipRGCs)可直接接受光信號的關鍵。我們視網膜上的神經節細胞可以通過視黑素以及雙極細胞（bipolar cells）和無長突神經細胞（amacrine cells）接受從視錐細胞和視桿細胞處傳來的光信號。這些神經節細胞形成視網膜下丘腦束（retinohypothalamic tract）通過釋放神經遞質谷氨酸鹽以及垂體腺苷酸環化酶促多肽apituitary adenylate cyclase activating polypeptide）傳遞信息至視交叉上核。視交叉上核是哺乳動物生物鐘的調控中心，就像調度中心，協調全身各個器官和組織的生物節律，維持穩定。

Kondratov, Roman V. Ageing Research Reviews 6.1(2007):12-27.

生物鐘與人類健康和衰老

核心生物節律基因直接或間接調控許多重要信號通路上的基因的波動性表達，包括調控代謝和線粒體生物合成的SIRT1、調節端粒長度的端粒酶、線粒體動力相關基因Fis1等。2016年哈佛醫學院布萊根婦女醫院Benjamin Ebert教授發表在著名學術期刊《Cell》上的研究發現節律周期蛋白BMAL1和CLOCK在幹細胞中的表達量顯著地高於前體細胞和終末分化細胞。而相比於BMAL1雜合型小鼠，BMAL1缺失小鼠中造血幹細胞的比例顯著下降，提示正常的節律對維持幹細胞功能有重要作用。這些研究提示我們，生物鐘與健康和衰老之間有密切的聯繫。 細胞內的生物鐘是通過什麼機制來調控衰老進程呢？匹茲堡大學Colleen McClung 研究團隊用對141個人的前額皮質區進行轉錄組分析，他們篩選出1000多個基因表達的周期性模式隨衰老發生了改變，其研究結果提示衰老過程中伴隨著生物節律的改變。 與此同時，科學家們也將目光鎖定在核心節律基因上，第一隻BMAL1 基因敲除小鼠2000年誕生於威斯康辛大學麥迪遜分校醫學院Christopher A. Bradfield 實驗室，發現BMAL1基因的缺失導致小鼠生物節律完全紊亂。美國克利夫蘭醫學中心Lerner 研究所Marina Antoch 實驗室的Roman Kondratov在此基礎下進行關鍵節律基因與健康和壽命之間的關係的研究。他們發現BMAL1缺失的小鼠平均壽命只有約37周，而野生型小鼠的平均壽命超過兩年。基因缺陷型小鼠還表現出嚴重的早衰表型包括：老年性肌少症、白內障、皮下脂肪減少，器官萎縮等。還有其他實驗室的研究表明，BMAL1缺失的小鼠出現不育、糖代謝功能受損等生理缺陷。

BMAL1 缺失的小鼠（C、D）與野生型小鼠 (A、B)相比，缺乏抵禦外界環境變化維持自身節律穩定的能力Bunger, Maureen K., et al. Cell 103.7(2000): 1009-1017.

BMAL1 缺失的小鼠壽命減少，體重降低，加速衰老Kondratov, Roman V., A. A. Kondratova, and V. Y. Gorbacheva. Genes & Development 20.14(2006): 1868-73.

此外，核心節律基因（BMAL1, CLOCK, NPS2, CRY, PER等）的缺失或多或少地會導致生物節律周期或振幅的改變並造成不同程度的健康問題。CLOCK突變導致小鼠生育能力的降低以及妊娠綜合症的高發，還有肥胖等代謝綜合症。在低劑量的輻射照射下，CLOCK突變小鼠更易發生嚴重的早衰癥狀。PER2 缺陷的小鼠表現出更強烈的酒精攝入傾向以及谷氨酸能代謝的改變，它們在接受輻射時有更高的癌變機會。 另一方面，與核心節律基因相偶聯的重要信號通路可能也是生物鐘調控的關鍵因素之一。中科院上海生命科學院張洪鈞研究員發現在年輕小鼠細胞內SIRT1 通過去乙醯化PGC-1α 蛋白，促進其與RORα的協同作用於 BMAL1的RORE啟動子區域，促進BMAL1的轉錄，BMAL1和CLOCK形成的異二聚體作為轉錄因子直接促進SIRT1依賴的NAD＋合成過程中的限速酶的Nampt的周期性表達，BMAL1和SIRT1由此形成正向的反饋調節循環。這一積極的正反饋循環隨著年齡的增長而顯著下降，BMAL1和SIRT1在年老小鼠大腦區域表達量與年輕小鼠相比有顯著下調，暗示衰老過程中生物節律對於代謝的調控機能的下降，該成果 2013年發表於《Cell》雜誌上。

老年小鼠大腦中的BMAL1和SIRT1表達量顯著降低Chang, H. C.,and L.Guarente. Cell 153.7(2013): 1448-60.

大腦SIRT1的高表達促進小鼠適應環境維持節律的能力Chang, H. C.,and L.Guarente. Cell 153.7(2013): 1448-60.

能否撥回「衰老的時鐘」？

在了解維持良好的生物鐘對於健康和延緩衰老的重要意義的同時，科學家們也在思考和探索如何在衰老過程中控制體內節律基因的表達，從根源上扼住衰老的步伐。REV-ERBα的轉錄受BMAL1和CLOCK調控，它還可結合到BMAL1 的RORE啟動子區，抑制BMAL1的轉錄，形成另一個負反饋循環。霍華德·休斯醫學研究所Michael Downes和Ronald Evans 研究團隊首次發現FBXW7靶向被CDK1磷酸化後的REV-ERBα，使其泛素化降解這條通路調控節律基因波動的振幅。敲除FBXW7來抑制這一過程可以改變節律基因波動的振幅而不影響其周期。這種調節顯著影響肝臟脂肪和能量代謝。這項研究於2016年1月發表於在《Cell》雜誌，為科學家們尋找調節生物鐘的機制提供了一個新的思路。

Xuan Zhao, et al. Cell, 2016, 165(7):1644-1657.

儘管科學家們目前還沒有發現能特異性地針對核心節律蛋白的能夠維持生物節律卻沒有副作用的「特效藥」，但人們仍然可以通過避免光污染和倒班工作等，保持與外界環境相協同的健康的睡眠循環以及攝食規律，維持生物節律的穩態。來自日本大阪大學的Nana Takasu 於2015年發表在《Cell Reports》的研究就表明，通過改變外界光照條件使其與CRY缺陷的中年雌鼠的生物鐘相匹配可以神奇地使雌鼠的發情周期重新規律化，回復青春時期的生育能力。調節好我們身體里的「時鐘」，維持健康的生物節律，可能就是最好的「不老葯」啦。

（插圖：竹一賢）

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