The Scientist：張鋒暢談其CRISPR/Cas9前沿性研究工作

Broad研究所的張鋒（Feng Zhang）博士是近幾年大熱的CRISPR/Cas9技術的先驅開創者之一。2013年，這位80後的年輕華人科學家開發出了可用來編輯DNA、敲除指定基因的CRISPR/Cas系統，自此之後一直致力於推動這一技術走向完美。而在改良及進一步操控CRISPR/Cas9這一工具使其更具特異性的同時，張鋒課題組也在尋求發現新的基因編輯蛋白。

近日，張鋒在The Scientist網站的一次網路研討會上，討論了他的課題組在CRISPR/Cas9開發與應用前沿開展的研究工作。

CRISPR技術的進展

張鋒探討了改造釀膿鏈球菌Cas9蛋白來提高特異性。當DNA與嚮導RNA之間配對不完美時，Cas9核酸內切酶可誘導脫靶突變，這使得它不適合用於臨床上精確地編輯基因組。

張鋒課題組通過結構分析揭示出，負電荷的非靶向DNA結合到了Cas9蛋白一個正電荷的凹槽中。張鋒說：「我們認為如果我們可以中和其中一些正電荷，那麼我們就可以減少不穩定性，由此使得Cas9更具特異性。」

他們利用已知會落在一些特異脫靶位點上的嚮導RNAs來嘗試了這種方法。研究小組構建出了32個具有單個點突變的Cas9突變體，藉助於已驗證易錯配的嚮導RNA將它們靶向EMX1基因。5個Cas9突變體保留了對EMX1的靶向編輯活性，而將對脫靶位點的切割減少到1/10。隨後該研究組嘗試利用這些突變Cas9s切割了另一種基因VEGFA。張鋒說，儘管所有的突變Cas9s都減少了脫靶效應，研究小組認為他們應該組合一些突變使得Cas9更具特異性。他們構建出了具有三個點突變的兩種不同的Cas9突變體，「發現我們能夠在保留打靶活性的同時，進一步降低脫靶活性，以致我們不再能夠檢測到它，」張鋒說。

張鋒將這些特異性增強型Cas9蛋白稱作為「eSpCas9變體」。測試大量的嚮導RNAs與具單個點突變的eSpCas9和具三個點突變的eSpCas9，科學家們發現兩種eSpCas9能夠以相似的效率編輯靶位點。儘管採用不同的嚮導RNAs效率存在一些差異，「平均而言，這些突變體的效率與野生型Cas9相當，」張鋒說。

通過嘗試組合各種嚮導RNAs變體與野生型Cas9，張鋒研究小組發現在嚮導RNA上有一個所謂的「種子區域」賦予了特異性。相比之下，新eSpCas9變異體擴展了這一種子區域。張鋒說，他的研究團隊正在繼續提高這一系統的特異性。

利用CRISPR發現未知的基因功能

張鋒說，CRISPR系統一個令人興奮的特徵就是嚮導RNAs的特異性。這使得構建出可靶向所有基因或特定基因內多個位點的一個慢病毒CRISPR嚮導RNAs文庫成為可能。隨後再將它們轉導到細胞系中，生成失活或激活個別基因的細胞池。

為了證實這些篩查的效力，張鋒課題組解析了黑色素瘤的耐葯。BRAF V600E是獲得美國食品和藥物管理局批准的藥物vemurafenib (Zelboraf)靶向的一個癌症突變。然而，快速突變的細胞會對這一藥物產生耐葯，到接受藥物治療24周時腫瘤會再度複發。

張鋒說：「我們認為這有可能是我們應用覆蓋全基因組的文庫來了解哪些基因賦予了腫瘤細胞對vemurafenib抗性的一次機會。」

張鋒的CRISPR基因敲除文庫利用了靶向基因組所有保守編碼外顯子的嚮導RNAs。「當設計這些類型的篩查實驗時，我們總是採用多個嚮導RNAs，確保我們有一些冗餘，能夠知道所有嚮導RNA的效應並非是由於脫靶改造所致。」隨後他們嘗試驗證了他們的新候選基因，並將他們的結果與以往完成的RNAi篩查進行了對比(Cancer Discov, 3:350-62, 2013)，發現他們可以證實頂部的幾個CRISPR擊中點賦予了vemurafenib耐葯；而在RNAi篩查中，只有最高的擊中點被證實。

張鋒課題組還開發了一些基於功能獲得性CRISPR的篩查方法。利用這一基於CRISPR的新工具來激活SAM基因，他的研究小組證實這一工具可以激活採用舊方法難於開啟的12種不同的基因。「有許多基因採用舊系統無法激活，這一新系統能夠激活轉錄達100倍或1000倍，」張鋒說。

張鋒實驗室現正在通過鑒別可用於基因編輯的其他酶，來進一步擴展CRISPR編輯工具箱。例如，去年秋天他們發現了另一種DNA核酸內切酶Cpf1，Cpf1不同的切割功能使得它在某些情況下更有用。他的研究小組還描述了其他的CRISPR/Cas系統C2c1, C2c2 and C2c3，並正在研究他們的機制。

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