Science：新方法讓RNA測序精準度提高至少3 10倍

2016年6月24日/生物谷BIOON/--HIV和HCV等逆轉錄病毒通過一種被稱作逆轉錄的過程將RNA複製為DNA。但是這一過程容易出錯，這是因為所有逆轉錄病毒進化樹上的祖先都沒有精確複製RNA的能力。

逆轉錄病毒是通過一種被稱作逆轉錄酶（reverse transcriptase, RT）的酶將RNA複製為DNA。不同於DNA聚合酶---以DNA為模板，複製出完全一樣的DNA鏈---的是，RT酶大多屬於具有古老進化起源的單個蛋白家族。它們缺乏3′→5′外切酶結構域，因而沒有3′→5′鹼基校對功能，不能夠校驗新合成的DNA中出現的一些鹼基錯誤，因而在逆轉錄時，容易出現突變。

自從發現逆轉錄以來，科學家們一直利用這一過程來更好地了解與遺傳疾病和人類健康相關的遺傳信息。然而，現存的RNA測序技術易出錯性仍然是一個棘手問題，必需加以解決。

在一項新的研究中，為了確定這種校對功能的缺乏是進化歷史上的偶然事件，還是逆轉錄的一種功能限制，來自美國德州大學奧斯汀分校的Jared Ellefson、Andrew Ellington及其同事們利用體外定向進化和蛋白工程等技術讓原核生物DNA聚合酶進化出熱穩定性的具有錯誤校正能力（即具有3′→5′外切酶活性）的被稱作逆轉錄異種聚合酶（reverse transcription xenopolymerase, RTX）的RT酶。RTX能夠高效地利用RNA模板高保真度地合成出DNA。相關研究結果發表在2016年6月24日那期Science期刊上，論文標題為「Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase」。

研究人員證實RTX保留了高效且又高精準度的校對功能，同時能夠將RNA複製為DNA。它將RNA複製精準度提高了至少3倍，最高可達10倍。這種酶使得科學家們第一次能夠以近乎完美的精準度大量複製RNA。

Ellefson說：「有了這種校對功能，我們的這種新酶提高了RNA測序的精準度和保真度。如果不能忠實地讀取RNA，我們無法準確地闡明細胞的內部工作機制。 [不能忠實地讀取RNA導致的]這些錯誤導致研究性實驗室中出現誤導性的數據和臨床實驗室中發生潛在的誤診。」

Ellington 說，「隨著我們邁向個人化醫療時代---對每個人的RNA轉錄物進行測序幾乎與測量脈搏那樣容易，測出的序列信息精準度將變得越來越重要。這項研究的意義在於我們如今也能夠複製在現代基因組中發現的大量RNA信息。這意味著基於基因組信息作出的診斷更可能是準確的。」（生物谷 Bioon.com）

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Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase

doi:10.1126/science.aaf5409

Jared W. Ellefson*, Jimmy Gollihar, Raghav Shroff, Haridha Shivram, Vishwanath R. Iyer, Andrew D. Ellington

Most reverse transcriptase (RT) enzymes belong to a single protein family of ancient evolutionary origin. These polymerases are inherently error prone, owing to their lack of a proofreading (3′- 5′ exonuclease) domain. To determine if the lack of proofreading is a historical coincidence or a functional limitation of reverse transcription, we attempted to evolve a high-fidelity, thermostable DNA polymerase to use RNA templates efficiently. The evolutionarily distinct reverse transcription xenopolymerase (RTX) actively proofreads on DNA and RNA templates, which greatly improves RT fidelity. In addition, RTX enables applications such as single-enzyme reverse transcription–polymerase chain reaction and direct RNA sequencing without complementary DNA isolation. The creation of RTX confirms that proofreading is compatible with reverse transcription.

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