磷酸化抗體使用必殺技

知識 07-26

作者：解螺旋·子非魚

導語

Western Blot是生物學上一種非常常用的實驗方法，與之相似的還有Southern Blot和Northern Blot。但WB失敗的情況也很多，這裡小魚有一些小技巧來盡量減少失敗的概率。

「我的WB又沒有雜出來，太桑心了」

「哇靠你的WB又沒有雜出來，用掉多少抗體了，還買進口的！」

「哇靠你的WB又沒有雜出來，卻一直一輪又一輪的佔用著蛋白電泳儀，我等到黃花都謝了！」

小魚說，這些聲音貫穿了她整個研究生生涯，WB，虐了她無數遍，然而鳳凰涅盤然後浴火重生，她從WB中參悟到了正確應對失敗的人生道理。而在正確應對失敗的同時，我們也要學會如何避免失敗。小魚今天給大家分享一下在用磷酸化抗體做WB時，應該注意些什麼。

1.警惕內部敵人

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一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，因為組織或細胞裂解時會釋放出大量磷酸化蛋白的死對頭——內源性蛋白磷酸酶，催化磷酸化蛋白(R-p)的去磷酸化，導致不同於正常生理狀態的差異。因此，外源性加入蛋白磷酸酶抑制劑，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維護蛋白質的磷酸化狀態，否則即使band壓出來也會很淺，結果也不可信。

2.低溫能讓他們緊緊地擁抱對方

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加一抗後最好4度過夜，低溫能讓抗體和目的蛋白緊緊地擁抱對方。為什麼？因為蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附，高溫下容易脫落。膜上的抗原脫落了，結合效率會低。4度也可使一抗重複使用多次。畢竟磷酸化的抗體都挺貴的。（土豪隨意）磷酸化的蛋白只佔總的蛋白量的極少部分，就像聯誼舞會上讓來賓多相處一會產生couple的概率會大很多那樣，過夜可以保證抗體和蛋白有充分的結合時間。二抗則室溫1小時即可。

3.磷酸化抗體哪家強？

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當然是 Cell signaling公司。他家做的磷酸化抗體不錯，尤其是MAPKs磷酸化抗體。最好根據廠商的protocol來操作實驗，這是實驗成功的保證。

4．他們不宜「喝奶」

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建議用含5%BSA的TBST稀釋phospho-p38等抗體，效果不錯，而不是用常見的含5%non-fat milk的TBST。因為脫脂奶含磷酸化蛋白豐富，是奶中磷元素的來源之一。

5.如何避免磷化蛋白君和總蛋白君在膜上「打架」？

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研究完某一蛋白的磷酸化情況後一般也要研究一下該蛋白總的表達量。但兩者的條帶位置一樣，怎麼做？可以這樣：壓完磷酸化抗體後，把相同的membrane做strip後再壓總蛋白抗體,然後再strip一次，再壓內標actin。

6.聽marker的，沒錯

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做磷酸化蛋白WB時,除了目標蛋白的band以外,往往會出現非特異性的band。磷酸化抗體不好的話,甚至會壓出非特異性的band,而沒有你想要的band,所以壓片以後,一定要根據markers比對一下,你壓出的band分子量是否正確。

7.洗滌也大有學問

洗滌對最後的背景影響也較大，millipore最近的說明書推薦用雙蒸水洗滌，效果很明顯，具體可以這樣：1st and 2nd抗體之間，DDW 5min X3次，2nd抗體後，DDW 5min X3次，TBST 5min X1次，DDW rinse 3-4次。對比TBST洗滌的membrane，效果有一定差距，背景有效降低，即使壓片30min，背景仍然是可以忽略的。

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