PLoS Pathog：利用CRISPR/Cas9有望靶向清除多種皰疹病毒感染

知識 07-04

大多數成年人攜帶著多種皰疹病毒。在初始的急性感染後，這些病毒在它們的宿主體內建立終生感染，並導致唇皰疹、角膜炎、生殖器皰疹、帶狀皰疹、傳染性單核細胞增多症和其他疾病。一些皰疹病毒還能夠導致人們患上癌症。在潛伏性感染階段，這些病毒長時間地保持潛伏狀態，但是保持偶爾重新激活的能力。這種重新激活有可能導致人們患病。一項新的研究提示著利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術攻擊皰疹病毒DNA能夠抑制病毒複製，而且在一些情形下，能夠導致病毒清除。相關研究結果於2016年6月30日發表在PLoS Pathogens期刊上，論文標題為「CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing of Herpesviruses Limits Productive and Latent Infections」。

CRISPR/Cas9系統靶向結合特異性的DNA序列，誘導靶DNA雙鏈發生精確切割。在哺乳動物細胞中，這樣的切割能夠被一種被稱作非同源末端連接（non-homologous end-joining, NHEJ）的緊急修復系統快速地修復。NHEJ是高效的，但是並不很準確，因而經常導致一些DNA鹼基在修複位點上插入或剔除。鑒於每次讀取DNA時是按密碼子（每個密碼子由連續的三個鹼基組成）讀取的，在關鍵位點上發生的這些小的DNA序列變化經常破壞相應的基因和它的蛋白產物的功能。

在這項新的研究中，來自荷蘭烏德勒支大學醫學中心的Robert Jan Lebbink和同事們認為應當能夠靶向作用於被感染的人細胞中的潛伏性皰疹病毒DNA並讓它們的DNA發生突變，因而潛在地阻止皰疹病毒相關的疾病。為了測試這一點，他們設計出特異性的嚮導RNA（gRNA），即與皰疹病毒基因組的關鍵部分互補的且發揮著分子地址作用的短RNA片段。這些gRNA當與CRISPR/Cas9系統中發揮著分子剪刀作用的Cas9結合在一起時，應當能夠誘導在皰疹病毒DNA的特定位點上發生切割，隨後誘導它們的DNA發生突變，從而破壞這些病毒。

通過採取這種方法，研究人員研究了三種不同的皰疹病毒成員：導致唇皰疹和皰疹性角膜炎的1型單純皰疹病毒（HSV-1）；人巨細胞病毒（HCMV），最為常見的病毒性出生缺陷病因（當這種病毒由媽媽傳播給胎兒時）；導致傳染性單核細胞增多症和多種癌症類型的愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus, EBV, 也被稱作EB病毒）。

利用被EBV潛伏感染的淋巴瘤細胞作為研究對象，研究人員證實將靶向特異性EBV DNA序列的gRNA導入這些淋巴細胞中能夠在特定位點引入突變。這些突變能夠破壞EBV病毒的重要功能，並且讓病毒DNA分子去穩定化。與此一致的是，研究人員報道利用兩種不同的gRA靶向一種HBV必需基因，能夠誘導95%以上的EBV基因組從宿主細胞中丟失。

在潛伏性感染期間，HCMV基因組作為環狀DNA分子存在於宿主細胞的細胞核中。一旦重新激活，HCMV複製進展緩慢。利用合適的gRNA，研究人員發現CRISPR/Cas9編輯能夠高效地破壞HCMV複製。然而，他們也觀察到能夠逃避CRISPR/Cas9編輯的HCMV變異體出現，這提示著在HCMV基因組多個關鍵性位點上同時進行基因組編輯是躲避抵抗性HCMV變異體產生所必需的。

相比於HCMV，HSV-1更加快速地增殖。研究人員首先設計出很多種gRNA，然後利用CRISPR/Cas9編輯靶向不同的HSV-1必需基因。他們發現它們中的多種gRNA能夠降低HSV-1複製。當將其中的兩種gRNA組合使用因而同時靶向兩種必需基因時，他們能夠完全抑制HSV-1複製。另一方面，在HSV-1潛伏性感染期間，也就是HSV-1 DNA沒有活躍地增殖時，他們不能夠誘導編輯。

研究人員總結道，「我們觀察到將EBV從被潛伏感染的腫瘤細胞中高度有效地和特異性地清除出來，以及破壞HSV-1和HCMV在人細胞中的複製。」他們繼續說道，「儘管CRISPR/Cas9並不能夠高效地對潛伏性HSV-1進行基因組編輯，但是一旦潛伏性HSV-1重新激活，利用HSV-1特異性的gRNA能夠高效地阻止HSV-1複製。」他們希望，他們的結果「可能允許設計出高效的治療策略靶向潛伏性感染和增殖性感染期間的人皰疹病毒。」

CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing of Herpesviruses Limits Productive and Latent Infections

Herpesviruses infect the majority of the human population and can cause significant morbidity and mortality. Herpes simplex virus (HSV) type 1 causes cold sores and herpes simplex keratitis, whereas HSV-2 is responsible for genital herpes. Human cytomegalovirus (HCMV) is the most common viral cause of congenital defects and is responsible for serious disease in immuno-compromised individuals. Epstein-Barr virus (EBV) is associated with infectious mononucleosis and a broad range of malignancies, including Burkitt』s lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, Hodgkin』s disease, and post-transplant lymphomas. Herpesviruses persist in their host for life by establishing a latent infection that is interrupted by periodic reactivation events during which replication occurs. Current antiviral drug treatments target the clinical manifestations of this productive stage, but they are ineffective at eliminating these viruses from the infected host. Here, we set out to combat both productive and latent herpesvirus infections by exploiting the CRISPR/Cas9 system to target viral genetic elements important for virus fitness. We show effective abrogation of HCMV and HSV-1 replication by targeting gRNAs to essential viral genes. Simultaneous targeting of HSV-1 with multiple gRNAs completely abolished the production of infectious particles from human cells. Using the same approach, EBV can be almost completely cleared from latently infected EBV-transformed human tumor cells. Our studies indicate that the CRISPR/Cas9 system can be effectively targeted to herpesvirus genomes as a potent prophylactic and therapeutic anti-viral strategy that may be used to impair viral replication and clear latent virus infection.

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來源：生物谷

本期編輯：biodog