CAR-T研發及產業化淺談
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作者：羅正強
來源：貝殼社
嵌合抗原受體修飾的T細胞（CAR-T）技術，經過十幾年的發展，現在已經發展到了可以成熟應用到B系白血病或淋巴瘤等的試驗性臨床治療方面，並且一些產品獲得了驚人的應答率，如諾華的CTL019在臨床試驗中達到93%的客觀緩解率。全球醫藥行業和金融資本對這一技術爭相追捧，國內外眾多以此技術「白手起家」的小型初創公司大獲資本青睞，如美國的JUNO和KITE公司，兩家只有20名左右員工的CAR-T研發製備公司，在臨床一期實驗之後就獲得了不菲的融資和金融市場反饋。
而在我國，CAR-T研發和產業化雖然起步較晚，但還是看到近兩年不斷有醫院和生物技術公司報道較為喜人的臨床試驗結果（至今註冊的臨床試驗項目已有33項之多，緊隨美國的54項），如解放軍301醫院韓為東教授（9項）、西南醫院錢程教授（2項）、博生吉醫藥科技有限公司楊林教授（2項）、仁濟醫院李宗海教授（2項）、上海細胞治療工程技術研究中心錢其軍教授（1）項等。
在國內從事CAR-T研發與製備的公司中，與解放軍總醫院301醫院生物治療科主任韓為東教授合作的西比曼公司走在前列，公司於2014年6月18日正式在美國納斯達克掛牌上市（股票代碼：CBMG），成為唯一在美國納斯達克上市的中國細胞生物醫藥科技公司。該公司目前進行了多項針對不同靶點的CAR-T臨床試驗，如CD19、DC20、CD30、EGFR等，均取得了較好療效，而針對實體瘤的CBM-EGFR.1在實體瘤臨床上取得較好療效，也證明其在CAR-T實體瘤治療領域處於國內乃至世界領先水平。
另外，上海細胞治療工程技術研究中心集團具有一定代表性，其擁有成熟的免疫細胞治療研發和產業化相關技術平台、精準醫療指導下的全產業鏈免疫細胞治療和健康管理等平台。到目前以來，已經擁有了40餘項免疫細胞治療相關專利，其中12項關鍵技術被國家專利產權保護部門認為涉及到國家重大戰略利益需要進行保密審查，其CAR-T研發和產業化方面，靶點不僅僅在血液腫瘤（CD19等），更逐漸拓展到實體瘤方面，如HER2、Mesothelin、EGFR、MUC I等，並且在臨床試驗中取得了較好的治療效果，多項臨床試驗正在進行中。該公司於今年4月份獲得了1.3億人民幣的B輪融資，公司估值達到8.3億元人民幣之多。
而除此之外，國內的諸多CAR-T研發和產業化相關企業中，藝妙神州的建立就是一個「白手起家」的典型案例。於2015年清華大學博士畢業、做癌症生物學相關方向研究的何霆，和兩位分別做臨床藥物設計和免疫學研究的同學，從2014年下半年開始進行研究，至2015年6月畢業，創辦了北京藝妙神州醫療科技有限公司，擁有7項專利，並拿到500萬元的天使投資，並由於一例臨床患者的良好治療效果，於2015年12月份，進一步拿到1000萬人民幣的preA輪融資。
那麼，CAR-T到底是什麼技術這樣具有魅力？它的前景如何？中美之間CAR-T研發和產業化之間有哪些異同？讓我們從CAR-T基本結構演化、目前面臨的挑戰、中美之間CAR-T研發及產業化對比、今後的研發和產業化方向這四個方面對這一技術進行一個全面了解。
一、CAR-T基本結構的演化
經過不斷試錯（初期一代CAR-T的無法有效激活及維持）和從教訓（早期臨床試驗中幾例病人的致死）中吸取經驗，CAR-T的結構隨著T細胞免疫激活雙信號機制的基礎研究發現等的逐漸進步，從只攜帶有CD3ζ胞內激活結構域的一代CAR，逐漸演化到攜帶CD28/4-1BB/OX40/ICOS等胞內共刺激結構域和CD3ζ胞內激活結構域的二代CAR（攜帶一個共刺激結構域），三代CAR（攜帶兩個共刺激結構域）。
並且，基於對安全性的進一步研究和突破，如應對細胞因子風暴時，諾華的CAR-T團隊採用IL-6抑制劑即可有效降低和解除該副作用，這一結構現在已經開始成功應用到臨床試驗，並且在針對CD19抗原或CD20抗原等的B系淋巴細胞白血病等的臨床試驗中取得了驚人療效，而應用二/三代CAR結構的針對其他靶點的CAR-T細胞，也在黑色素瘤、前列腺癌、頭頸部癌症、肺癌等中進行臨床試驗。
面對實體瘤高異質性、腫瘤相關抗原（TAA）特異性不高導致脫靶效應（on target/off tumour）等方面問題，實驗室研究中的一些報道，採用了雙信號CAR結構，該結構採用兩個獨立的CAR結構，將提供T細胞激活的第一信號CD3ζ胞內結構域，和提供第二信號的共刺激受體CD28/4-1BB/OX40等的胞內信號結構域分開，分別連接至兩個獨立的CAR結構胞內，胞外採用兩個靶向不同TAA的單鏈抗體（ScFv），取得了一定的針對實體瘤動物模型治療效果，並有效防止了脫靶效應。
在此結構基礎上，一些團隊還進行了對胞外單鏈抗體的優化，分別使兩個單鏈抗體擁有不同的針對TAA的親和力，如對提供第一信號的CAR使用低親和力，而對提供共刺激作用的CAR採用較高親和力，這樣能夠在一定程度上提高防脫靶作用。另外，也有團隊嘗試進行了稱為iCAR的設計，將提供免疫抑制信號的PD-1受體的胞內段信號結構域，連接到攜帶針對正常細胞抗原ScFv的CAR上，與靶向TAA的二代或三代CAR組成雙信號受體結構，在動物模型中能夠有效避免對正常組織的副作用。
在面對實體瘤由於PD-L1高表達而導致的免疫抑制方面，最近也有團隊在上述雙信號獨立CAR結構基礎上，將PD-1受體的胞內抑制性結構基序替換成CD28分子的胞內激活結構域，與靶向TAA的二代CAR組成雙信號受體共同表達，使這一新嵌合受體與T細胞原本的PD-1受體競爭性結合PD-L1從而扭轉免疫抑制，從而能夠提高CAR-T對實體瘤的殺傷作用。
此外，尚在臨床前實驗階段的CAR結構，有在二/三代CAR基礎上，在CAR的基因表達框內同時攜帶獨立組成型表達或誘導型表達的免疫調控因子基因，如IL-12/IL15/anti-PD-1等，將其稱之為第四代CAR，這樣的結構能夠在針對實體瘤時，面對其微環境的免疫抑制和實體瘤高異質性方面發揮一定的促進殺傷作用。
而面對有些由於身體原因以及經過多次放化療導致免疫細胞活性很差，從而不適宜進自體CAR-T治療的患者，通用型CAR-T（universal-CAR-T,uCAR-T）無疑是最佳選擇，業內將其稱之為第五代CAR-T這方面已見報道的有Cellectis公司2013年的科研論文及其近期對一例幼兒白血病患者治癒的報道。近期，我們也可以看到Baxalta公司與基因編輯公司Precision BioSciences宣布達成合作，開發基於健康供體T細胞的新型嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T)，以用於多種癌症的治療。
所以，CAR-T結構的演化，逐漸在解決其面對的問題中前進，至今已經演進至五代CAR結構，而臨床試驗應用中多以二/三代CAR結構為主，其他CAR結構還需要進行更多的優化和提高以應對臨床實際應用中對療效和安全性的要求。目前臨床中應用的靶點總結如下：
（圖片來源於網路）
二、目前CAR-T研發和產業化中面臨的問題
從目前CAR-T的臨床前實驗研究結果和臨床應用方面來看，遇到的問題主要分為以下幾個方面：
1、靶標抗原的選擇及其靶向問題。
由於CAR-T使用其胞外單鏈抗體進行對腫瘤細胞表面相關抗原（TAA）或腫瘤特異性抗原（TSA）的靶向結合，進而通過其胞內結構域激活T細胞進行對腫瘤細胞的靶向殺傷，所以靶標抗原的選擇對於這一特異性殺傷作用至關重要。而由於腫瘤細胞表面很難有TSA可供利用（CD19的特異性表達也是CAR-T在B系白血病和淋巴瘤等治療方面如此成功的一個因素），導致一系列靶向TAA的CAR-T因為脫靶效應而出現嚴重副作用，典型的如靶向HER2的臨床實驗失敗案例。所以現在急需要找到和開發更多可供利用的腫瘤特異性抗原。這方面，筆者所在團隊設計的精準醫療指導下的腫瘤基因突變新抗原全人源化抗體匹配篩選系統，通過創新設計的篩選方法和抗體Fab庫建立方法，有望能夠發現更多可用的腫瘤特異性新抗原。
而針對TSA/TAA的有效靶向問題，需要根據不同的抗原表達情況和癌種的不同，選擇不同的ScFv，例如，針對NY-ESO/CD19等特異性較高的抗原，可以採用高親和力ScFv實現對CAR提供較強的結合力從而使其更迅速地激活啟動的殺傷，而對於腫瘤特異性調高表達的TAA，適宜採用中等親和力的ScFv以實現降低脫靶作用等副作用的發生。另外，針對微環境形成較為緊密和「頑固」的實體瘤，採用特殊策略輔助ScFv提高靶向性和免疫突觸有效形成，將有助於CAR-T更好地發揮殺傷作用，與此同時，目前的雙信號獨立的CAR-T結構或者雙特異性CAR-T結構，都需要在這一方面做一定改進和考慮。
2、胞外單鏈抗體的人源化問題
目前，臨床應用中的CAR-T治療已經明顯證明，採用鼠源性的胞外單鏈抗體序列將導致CAR-T回輸至患者體內後很快因為免疫原性而導致免疫排斥和清除，這是導致部分臨床試驗效果較差的原因。所以今後對胞外單鏈抗體進行人源化改造，或者直接採用全人源化抗體庫篩選靶點進行匹配，從而依託精準醫療方案指導CAR-T應對更多特異性靶點，以及提高體內療效，將是一個趨勢。
3、T細胞基因修飾問題
目前製備CAR-T，對於T細胞進行CAR基因修飾，採用較多的載體為慢病毒載體/逆轉錄病毒載體，其次為電穿孔載體等。這些載體，在進行基因修飾的時候都面臨是否進行整合型修飾、整合位點選擇、修飾過程對T細胞的損傷、修飾效率提高等問題，這些技術問題在初始研發CAR-T過程中是比較重要，成熟以後可以直接應用於針對多種靶標的CAR-T。
首先我們來聊聊修飾方面方面的整合問題。是否進行整合型修飾以及整合位點選擇，要與修飾前所選擇的T細胞類群、所治療的腫瘤類型及選擇的TAA特異性高低進行權衡，因為整合位點選擇不當或非整合性修飾而導致的CAR丟失，將導致CAR-T過早失去功能，這對於較頑固的腫瘤治療不利；而整合型修飾結合修飾前T細胞亞群選擇導致記憶性CAR-T的形成，這在一方面能夠有效防止複發，但是這僅僅限於選擇的TAA/TSA特異性較高的情況下才有利，否則將導致副作用的長期存在，如針對B細胞白血病一類的CD19-CAR-T，形成記憶性CAR-T長期存在於患者體內將極大地不利於患者的健康，因為這將導致患者長期的B細胞發育不健全，而這一情況還是比較好的，如果是針對實體瘤的TAA，如果該TAA在正常組織或者器官表達，將長期存留髮生嚴重副作用的可能。
另外，整合型修飾中整合位點是否導致突變產生，從而導致修飾後T細胞出現壞死、失能等，都是需要解決的問題，所以在整合修飾載體的插入位點方面，需要進行一定研究，最好能夠使其定點整合，而對於選擇靶點特異性不高的腫瘤進行治療時，應考慮進行瞬時轉染、少量多次治療。另外，在CRISPER/cas9或者TALEN技術結合應用的情況下，可考慮進行通用型CAR-TZ製備中TCR定點敲除的同時加入特定位點，後期進行CAR的定點嵌入修飾。
然後，再來談談關於修飾過程中對T細胞的損傷問題。對於慢病毒載體、逆轉錄病毒載體等，轉染時對T細胞的損傷較電穿孔載體輕，這也在一定程度上取決於病毒類載體結構設計、製備方法、轉染前T細胞狀態等，而電穿孔載體對於T細胞的損傷是無法避免的，唯一能做的就是想辦法將其降到最低，這方面可以根據載體大小、T細胞狀態等情況優化電轉條件，載體中添加入核引導序列、根據不同T細胞亞群改進PB/SB載體結構等。這方面，筆者所在團隊設計的新型電穿孔載體結合優化後的電轉條件，將有望能夠很好地降低損傷和提高修飾效率問題。
修飾效率方面的問題，在添加特異性修飾篩選標籤或者結合CAR特異性磁珠篩選富集，後期進行CAR特異性刺激激活和增殖，在修飾前分選並短期激活的T細胞量達到108的情況下，則只需要修飾效率達到30%以上即可滿足要求。當然，為了實現短期製備細胞要求，在後期特異性誘導增殖方面盡量縮短時間，達到6-8天製備得到臨床需求量和狀態，則需要將修飾效率提高至50%以上。
4、T細胞修飾前細胞亞群的選擇問題
基因修飾前細胞亞群的選擇問題，直接決定了後續治療效果的差異，單純選擇CD4+T細胞或者CD8+T細胞都不能提供有效地殺傷，而直接對PBMC進行修飾，將同時對其中的Treg細胞等發揮抑制性作用的細胞進行CAR修飾，這對於實體瘤的治療是不利的。所以在基因修飾前進行的T細胞分選中，需要進行優化選擇合適的細胞亞群比例，以及優化分選手段降低對細胞的損傷。在CAR-T針對實體瘤的治療中，由於實體瘤龐大的細胞數量和免疫抑制情況，修飾前細胞亞群選擇這一方面，還需要根據針對不同癌種和不同修飾載體、TAA特異性高低等情況進行進一步摸索和優化。
5、CAR-T細胞的培養和分選問題
如何進行對CAR-T細胞經過基因修飾之後的進一步激活和培養，將對其回輸後的療效產生顯著影響。而如果採用與普通的CIK細胞刺激培養方法一樣的方法，將導致CD3/CD28集簇按照T細胞本來方式形成，以及以本方式激活之後導致抑制性受體的調高表達，從而導致CAR結構無法在回輸後有效形成免疫效應結構，進而影響治療效果。所以，單獨對CAR的激活和後期採用對CAR的分選，將顯著影響CAR-T的療效。這一問題，目前還需要進行更多研究和觀察，因為很多開發者進行的該方面工作並不能保證CAR的有效修飾和培養激活，所以目前得到的臨床試驗結果以及正在進行的臨床試驗，還不能夠深入到這一塊對臨床效果影響方面的研究。另外，分選方法方面，如何有效降低對CAR-T細胞的損傷也是至關重要的。
6、實體瘤免疫抑制問題
實體瘤由於其具有的免疫抑制微環境、瘤體聚集緊密等原因導致免疫細胞治療對其療效不佳，目前CAR-T也面臨同樣的問題。我們可以採用PD-1/PD-L1抗體和CTLA-4抗體，將其與CAR-T協同進行治療，但是這樣的治療還是會受限於這一類免疫檢查點抑制劑的部分系統性副反應。這方面，目前有研究者嘗試採用CAR-T同時攜帶胞內表達抗PD-1/PD-L1抗體，突破實體瘤免疫抑制的同時降低副反應，但這樣的手段需要開發一種較高效的基因表達載體和表達調控策略。
可喜的是，上海細胞治療工程技術研究中心集團正在嘗試進行這一方法的產業化工作，並取得了較好的初步臨床試驗效果。而除了這些檢查點導致的免疫抑制外，腫瘤微環境中還有的IDO、腫瘤低氧酸性微環境特徵、糖代謝競爭等，都是免疫限制因素，這些方面綜合起來，都需要開發一些相應的方法進行進一步的CAR-T自身的調控或者與相關製劑的協同治療。這方面，筆者所在團隊正在開發的新型實體瘤特異性CAR結構，將有望能夠依靠新型CAR結構內部特殊的信號結構而突破T細胞免疫抑制信號的胞內傳遞，以及突破實體瘤有氧糖酵解導致微環境缺乏葡萄糖而導致CAR-T細胞免疫信號傳遞失能問題。
另外，大多數實體瘤，如胰腺癌、肝癌、胃癌等，與血液系統腫瘤相比，都具有瘤體聚集緊密、內部血管深入不足等問題，這導致CAR-T細胞無法有效趨化至腫瘤灶、無法深入瘤體內部以及瘤體內失能等問題，這方面需要進一步研究策略予以解決。
7、複發問題
雖然CAR-T在血液系統B系白血病方面應用，能夠有效清除腫瘤細胞，但是隨著CAR-T細胞在血液中的衰亡、CAR丟失或靶抗原突變等原因，其中也有許多患者在腫瘤清除後一段時間後出現複發，所以這一問題是不得不面對的。現在，根據不同的複發情況，一般採用的方法是繼續回輸、結合放化療或者靶抗原更換。
8、安全性問題
安全性問題，尤其是CRS問題，是CAR-T臨床應用中不得不面對的一個重要問題，這方面，在靶點選擇、胞外單鏈抗體親和力選擇、回輸細胞量、回輸後病人體征監控、IL-6抑制劑等抗CRS藥物使用時機/劑量、剎車系統啟動時機等都需要根據不同癌種、病人特徵、不同癌症負荷等方面根據臨床試驗進行摸索優化。
9、產業化製備及政策
產業化製備方面，需要對T細胞分選、CAR-基因修飾、培養、回輸前質檢等方面建立完備的技術標準，在相應的流程和崗位建立SOP和配備專業的操作人員及設備、建立相應符合要求的細胞製備環境。另外，由於目前歸屬於自體細胞治療技術，現行政策急需明確CAR-T今後發展路徑，即按照藥物進行開發和監管還是按照臨床技術進行，這將對於CAR-T在國內的今後發展影響甚大。而對於多區域製備中心的建立，筆者認為目前為時尚早，需要進一步明確國家和地方政策。
三、中美之間CAR-T研發及產業化對比
1、研發方面，美國遙遙領先中國
通過對中美之間的CAR-T研發相關專利和文獻的對比，我們可以發現，美國作為CAR-T技術的發源地，在這一技術的研發方面遠遠領先中國，包括CAR-T結構方面的專利數量、結構的創新性方面以及CAR-T基本機制等的創新性研究方面，基因修飾載體方面研究，細胞培養等等方面。而反觀國內，大部分專利和研究文獻都是停留在更換靶點，對美國公布的CAR結構的局部創新性改進和優化等；可喜的是，雖然如此，也難得有一些專註於腫瘤免疫細胞治療方面的生物技術公司和科研單位做出了卓越的創新性研究，如上海細胞治療工程技術研究中心集團有限公司，就擁有多項自主研發的新型CAR結構、基因修飾技術、細胞培養技術等方面的專利，這些原創性的工作對於中國的CAR-T後期發展和實現彎道超車都是有很大意義的。
（圖引自搜狐）
2、產業化方面，中國正在奮力追趕
從近兩年的CAR-T有關的產業化新聞報道方面，我們可以看到，美國由於研發技術、資本投資環境、產業化高效、政策環境等方面的領先，出現了諸如JUNO、KITE等微小型技術性初創企業迅速崛起，並獲得資本追逐，而另外一些醫藥巨頭，如諾華等公司投入大量財力與技術擁有者賓夕法尼亞大學的Carl June教授團隊合作，迅速領先，預計其CTL019能夠在2017年獲批上市，這已經領先其他團隊。
但是由於CAR-T具有技術極強的屬性，其他團隊和公司也展現出極大的追趕力度，而中國由於研發人員和醫藥產業界的積極合作，在CAR-T的產業化合作和開發中展現出良好的發展勢頭，如2015年2月9日，中國解放軍總醫院（301醫院）與美國生物製藥公司Cellular Biomedicine（CBMG）達成協議，由後者收購了前者的CAR-T細胞療法的海外生產和銷售權，這項收購包括CD19、CD20、CD30、以及人表皮生長因子受體（EGFR）重組表達載體等免疫技術，已有的臨床I/II期結果、相關專利的所有權、以及生產技術。
而2016年4月11日，中源協和發布公告稱，該公司擬以自有資金5,800萬元購買中國醫學科學院血液病醫院（血液學研究所）（以下簡稱「血研所」）擁有的兩項CAR-T專有技術及依託於該技術申請的相關專利。除了這兩大宗專利交易，中國的許多擁有基本的免疫細胞技術研發能力的生物技術公司與一些醫院、科研單位緊密合作，也在這一技術的產業化方面做出了許多成績，如西比曼公司，與北京301醫院的韓衛東教授團隊合作開發的一系列靶點的CAR-T技術，已經成功推進到了I/II期臨床試驗，其他如博生吉醫藥科技有限公司楊林教授（2項）、仁濟醫院李宗海教授（2項）、上海細胞治療工程技術研究中心錢其軍教授（1）項等，也都在緊鑼密鼓地推進臨床試驗和進一步的研發工作，相信如果政策方面有利於該技術的進一步產業化和臨床應用，以及出現更多的創新性技術，我們國內的CAR-T產業化和臨床方面存在彎道超車的可能。
四、今後的研發和產業化方向
從以上的CAR-T基本演化、遇到的問題和挑戰以及中美之間研發和產業化之間的對比，我們可以得出，CAR-T這一技術在今後的研發和產業化發展方向，至少在中國的發展方向，可能在以下方面存在技術突破：
1、通用型CAR-T產品
CAR-T，其前期發展作為一種免疫細胞治療技術，得益於其天然具有的免疫殺傷作用和後天經過改造賦予的靶向識別優勢，其經過自體細胞的基因修飾培養激活後經過回輸，如今的技術，已經能夠使其作為一種的活的藥物，對特定的腫瘤病人帶來生存希望和極大地改善生活質量，減少類似於放化療因治療所遭受的痛苦。
而與此同時，因受限於免疫系統自身的某些限制性因素，如異體回輸時由於免疫原性等原因導致的免疫排斥、移植物抗宿主反應（GVHD）等，這將限制該技術廣泛性和便捷性應用，同時也在一定程度上提高了該技術的成本，另外，對於一些經過多次放化療而摧毀免疫系統或者使T細胞功能弱化的腫瘤患者，其自體的T細胞是不適合製備CAR-T進行腫瘤治療的。所以，通用型CAR-T技術將是今後的一個方向，在基因編輯技術如CRISPER-Cas9等的進步下，如果能夠實現對健康供體來源的T細胞TCR及其他導致不同個體間免疫原性的基因的敲除，將會使CAR-T這一技術真正成為一種活的藥物，進而能夠廣泛而方便的供合適的患者使用，並極大地降低成本。
在這一方面，近日有報道指出，Baxalta公司與基因編輯公司Precision BioSciences宣布達成合作，開發基於健康供體T細胞的新型嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T)，以用於多種癌症的治療。根據協議，雙方將選擇六個腫瘤靶點進行開發合作，並計劃在2017年下半年將第一個候選療法推進臨床階段。Precision BioSciences將主要負責II期臨床及之前的研發工作，Baxalta則將主導後期開發和商業化的工作，並支付相應的里程碑款項，涉及金額總計約16億美元。
2、實體瘤特異性CAR-T
目前的CAR-T技術在血液腫瘤中的B系白血病及淋巴瘤等方面的治療中展示出驚人的療效，但是由於實體瘤具有其自身不同於血液腫瘤的諸多特徵，如腫瘤微環境的免疫抑制、實體瘤局部的高密度大量的腫瘤細胞壓力、實體瘤的高異質性等，這使得針對實體瘤的CAR-T無法展現有效的治療效果。所以，在針對實體瘤這一腫瘤的主陣地方面，現在的CAR-T還需要做更多工作來進行對實體瘤的治療，包括實現CAR-T向實體瘤部位的有效趨化、有效應對實體瘤高異質性、安全而有效地突破實體瘤免疫抑制。要同時實現這些方面，需要研發工作者進行更多大膽的嘗試和創新，針對實體瘤開發特異性的CAR結構，這一方面筆者目前所涉及的幾種全新的CAR結構有信心能夠實現這些方面的突破。
3、胞外單鏈抗體人源化改進的進一步優化
在CAR-T回輸進行治療過程中，還有個問題是不得不面對的問題，就是胞外單鏈抗體的人源化改進，因為直接使用動物來源的胞外單鏈抗體，在諸多臨床試驗中證實會很快由於免疫原性問題導致其被宿主免疫系統清除，進而導致治療失敗。而在對動物來源的胞外單鏈抗體進行的人源化改進優化工作中，目前的手段雖然能夠實現明顯降低免疫原性，但是這一方法耗時耗力且由於其中某些序列還是會誘導產生諸如不完全抗體等問題，而導致其對抗原蛋白的親和力下降，甚至不敏感，而導致迅速複發，並且體內還能夠檢測到CAR-T的存在，這已經在一些臨床試驗中被報道。
所以，如何實現對胞外單鏈抗體的無免疫原性化改進和優化，將是未來的一個方向和技術突破口。筆者近期所設計的一種基於精準醫療指導下的腫瘤突變相關新抗原篩選及全人源化抗體匹配模型系統，相信能夠很好地解決這個問題。
4、簡化而安全的突破實體瘤免疫抑制技術
目前，針對實體瘤的腫瘤微環境免疫抑制方面的突破，比較有效的方式是結合抗PD-1/PD-L1抗體或CTLA-4抗體，但這一方式由於這類免疫檢查點抗體本身的副作用限制，在提高CAR-T的治療效果的同時也或多或少地引入了新的副作用。比較好的方式是敲除T細胞本身的PD-1受體等抑制性受體，但是這一途徑必須要求配合特異性很好的靶標抗原或者其他自殺開關以確保安全性，而這一受體的敲除相信在CRISPER-Cas9技術的進步下能夠很快實現。
除此之外，還有一種更好地方式，就是採取CAR-T細胞內部同時表達抗PD-1/PD-L1抗體，這樣一來就好比給CAR-T穿上為了一層護甲，但是這需要在轉染載體和基因結構方面進行進一步優化，以實現抗PD-1/PD-L1抗體的高效表達以達到戒除免疫抑制作用。這方面，上海細胞治療工程技術研究中心集團有限公司擁有該方面專利和技術，已經在激活的T細胞實現抗體的高效表達（稱為PIK-T），而目前正在致力於將這一抗體和CAR一同實現高效表達的產業化。
5、新的TSA/TAA安全性靶向技術
在提高CAR-T的靶向性方面，防止產生脫靶效應方面，要麼致力於發現更多可以利用的腫瘤細胞特異性抗原（TSA），而這一方面需要做大量工作，近年來發展的精準醫療相信會對這一方面工作提供有效的促進，筆者最近致力於設計完善的精準醫療指導下的腫瘤突變相關抗原全人源化抗體篩選匹配系統模型，相信會在這方面有較大潛力。除此之外，如能夠開發一種特異性的靶向實體瘤TAA的胞外結構，從而實現較多的TAA可以通過這一結構進行安全地靶向，筆者近期正在著手開發的策略和結構相信對這一方面問題的解決有極大潛力。
6、有效的防複發策略
由於複發問題是CAR-T不得不面對的一個問題，在清除腫瘤細胞之後，CAR-T也逐漸被清除，這將導致某些表面抗原調低表達、抗原丟失等的腫瘤細胞的得以壯大而導致複發，所以，在TAA特異性較高而不必擔心出現後續的脫靶毒性等問題時，如何選擇合適的胞內共刺激結構域以及修飾前的細胞亞群，使得部分CAR-T能夠以記憶性T細胞形式繼續存在，並且CAR為整合型。另外，一個可能的策略將是採用精準免疫細胞（即負載多種腫瘤新抗原的DC激活的新抗原特異性CTL）來修飾成CAR-T，使其具有主抗原靶向激活下的多種抗原系統性殺傷活性，這一方面，上海細胞治療工程技術研究中心集團有限公司正在做相關研究，希望能夠有所突破。
7、簡化的製備手段和封閉式細胞製備設備
在uCAR-T基礎上，結合雙特異性抗體等策略，CAR-T在安全有效的前提下作為藥物使用的可能性正在逐漸變為現實，今後，CAR-T製備產業化方面，需要開發更為簡化的短時間培養方法和技術，並為了降低人工操作帶來的細胞產品質量差異及提高產品質量，需要進一步開發一體式連續封閉培養設備，將T細胞分選、培養、基因修飾整合到一起，在同一台儀器內實現，並有效保持產品的質量和一致性。
綜上而言，CAR-T技術的研發和產業化發展，在今後幾年之內，借力於基因編輯技術和精準醫療事業的進步而將迎來快速發展，讓我們拭目以待。
作者簡介：
羅正強，男，（1990年4月—），甘肅省臨夏市人，就讀於浙江理工大學生命科學學院，生物學碩士專業，師從於我國腫瘤免疫細胞治療專家錢其軍教授。目前設計並正在著手開發3項新型實體瘤特異性CAR-T技術、1項新型嵌合趨化受體修飾的T細胞技術（Chimeric chemokines receptors，CCR-T）及新型電穿孔PB轉座酶載體及其相應修飾培養技術，已完成團隊組建，正在進行公司建立和融資孵化事項。
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