60年三獲諾獎，幹細胞領域那些名垂青史的發現
人體胚胎細胞的分化過程，圖片截取自Euro Stem Cell
編者按：
20世紀50年代，幹細胞研究領域的弄潮兒陸續登場，彼時幹細胞研究仍處在萌芽時期。隨著細胞核移植等技術的發展，普通細胞也可重新逆轉成為具有全能分化的幹細胞。2006年，日本科學家山中伸彌僅通過四種細胞因子，即可將普通細胞逆轉成幹細胞，頓時讓人眼前一亮。在對青蛙，小鼠和線蟲的研究中，湧現出了許多傑出的科學家，他們出色的工作不僅贏得了多個諾貝爾獎，讓我們得以窺探細胞生物學領域神奇的秘密，還帶來了醫療技術革命：幹細胞移植。
撰文 | 郭龍華（猶他大學、斯托瓦斯醫學研究所）
責編 | 葉水送
我們知道，受精卵在胚胎髮育過程中產生眾多形態以及功能特化的細胞，這一過程稱為細胞分化。受精卵的這一特性，稱為細胞的全能性（totipotency）。這可使其通過細胞分裂、分化，最終變成具有不同細胞類型、複雜多樣的動物或植物。事實上，最經典、深入的受精卵分化以及細胞譜系研究是在線蟲（Caenorhabditis elegans）中完成的。
線蟲是生活在土壤里，透明的，大小僅約1毫米的線狀小蟲。由於它們身體透明、細胞數量適中，使得英國生物學家約翰·薩爾斯頓（John Sulston）僅通過顯微鏡觀察，即可清晰地勾畫出完整的、從單細胞（受精卵）到959個成體細胞的分化過程——這部分工作於1976年陸續發表。
細胞分化研究的模式動物之一：線蟲，圖片來自uu.nl
2002年，薩爾斯頓因這一工作及對細胞死亡的研究，與他的導師悉尼·布倫納（Sydney Brenner）以及美國生物學家羅伯特·霍維茨（H. Robert Horvitz）一同分享了諾貝爾生理學或醫學獎。
約翰·薩爾斯頓（John Sulston，右）2002年獲諾獎。來源：The Nobel Foundation
「恐怖片」一樣的發現
雖然胚胎髮育過程中受精卵的分化早已被認識到，但在20世紀50年代，發育中或成體中的幹細胞概念並沒有確立，對細胞分化的理解也不夠深入。最重要的發現源自於勒羅伊·史蒂文斯（Leroy Stevens）在小鼠同系繁殖（inbreeding）中的工作。有一天他發現品系129小鼠有著巨大的陰囊（scrotum），於是與技術員一起殺了幾隻這個品系的小鼠，發現在其精囊中有頭髮、牙齒和血管。這個如同「恐怖片」一樣的發現，是幹細胞研究史上的一個里程碑。史蒂文斯由此發現了畸胎瘤（teratoma）。
Leroy Stevens（1920-2015）, 圖片來自ellsworthamerican.com
在後續的工作中，他發現癌組織中的部分細胞可被移植到正常的小鼠身上，誘導畸胎瘤的發生。如果被移植到腹膜腔，這群細胞能夠發育成胚狀體（embryoid bodies），這是一種類似於胚胎的培養體。進一步研究發現，這些癌組織由原生殖細胞（primordial germ cell）發育而來。移植129品系小鼠的原生殖細胞、早期胚胎細胞到成體小鼠體內，同樣能誘導畸胎瘤的形成。雖然沒有直接的正常胚胎幹細胞的研究予以佐證，但他於1954年發表的論文，預言了胚胎幹細胞的多能性、分化以及自我複製的能力，奠定了胚胎幹細胞研究的基礎。
另外兩位學者，比阿特麗絲·敏茨（Beatrice Mintz）和卡爾·伊爾門塞（Karl Illmensee）通過向正常小鼠的胚胎注射單個畸胎瘤幹細胞，證明這些幹細胞可分化為正常的體細胞和生殖細胞，胚胎期注射獲得的成體小鼠沒有畸胎瘤。馬丁·伊萬（Martin Evans）獲得史蒂文斯饋贈的129品系後，進行體外畸胎瘤組織的培養、多能性和細胞分化研究，成功完成了129品系和正常小鼠胚胎期細胞內細胞團（inner cell mass）的體外培養和分化，並最終確定了胚胎幹細胞（Embryonic Stem Cell）的概念。
體外培養的胚胎幹細胞可在移植後成功分化為生殖細胞和多種體細胞，並將它們的基因型傳遞到下一代。這一特性稱為幹細胞的多能性（Pluripotency），與受精卵的全能性相對應。因這項工作及其編輯小鼠目標基因的貢獻，伊萬與馬里奧·卡佩奇（Mario R. Capecchi）、奧利弗·史密斯（Oliver Smithies）分享了2007年諾貝爾生理學或醫學獎。
馬丁·伊萬（Martin Evans，中）2007年獲諾獎。來源：The Nobel Foundation
在1998年，使用小鼠中建立的原理，詹姆斯·湯姆遜（James Thomson）成功實現人胚胎幹細胞的體外培養，獲得社會媒體的高度關注。
一次著名的重複實驗
同樣是在20世紀50年代，另一部分學者在進行著完全相反的研究。已分化的成熟細胞是否能夠重新獲得類似於受精卵（或幹細胞）的特性？細胞分化的過程是不是丟失了部分基因，抑或是抑制了這些基因的表達？這樣的抑制機制是否可逆？
最早試圖解決這個問題的是1935年的諾貝爾生理或醫學獎獲得者漢斯·斯皮爾曼（Hans Spemann）。他使用頭髮絲對蠑螈的受精卵進行精細地操作，證明4次分裂後的胚胎細胞的細胞核依然具備全能性。使用更晚期的胚胎細胞，甚至完全分化的細胞核，最著名的實驗莫過於在青蛙中進行細胞核移植。這個實驗僅分為兩步：首先，取走卵細胞的細胞核，僅保留細胞質；其次，取出已分化的細胞核，並轉移到卵細胞的細胞質中。
1952年，羅伯特·布里格斯（Robert Briggs）和托馬斯·金（Thomas King）完成了在美洲豹蛙（Rana pipiens）中未受精卵細胞和已發育胚胎細胞之間的核移植，結果證實移植成功的卵細胞能夠發育成正常的青蛙，但是他們同時也發現使用相對更晚期的胚胎細胞，移植後的卵細胞不能像正常受精卵一樣獲得全能性。他們推測，在胚胎髮育過程中，細胞核可能丟失了部分基因，或者不可逆地抑制了部分基因的表達。英國科學家約翰·戈登（John Gurdon）在他博士導師米徹爾·菲施貝格（Michail Fischberg）的建議下，在非洲爪蟾（Xenopus laevis）中重複了該實驗。有趣的是，戈登首先發現胚胎晚期的細胞核同樣能夠使得移植後的卵細胞獲得全能性，從而推翻了布里格斯和金的結論。
左：美洲豹蛙；右：非洲爪蟾；圖片來自wikipedia
隨後戈登使用已完全分化的腸道表皮細胞的細胞核來最終確定已分化細胞核在移植後可以獲得全能性。在其讀博士後期間，菲施貝格和他的助理照顧著這群爪蟾直到成年。戈登建立自己的實驗室後，他確定這些爪蟾能夠產生正常的後代，從而用實驗證明細胞分化過程中基因組沒有發生變化，並且已抑制的基因表達可以被逆轉，為誘導去分化（將分化細胞轉變成幹細胞）奠定了理論和技術基礎。事實上，在不破壞細胞的情況下實現誘導去分化，大概又過了40年，直到日本科學家山中伸彌（Shinya Yamanaka）的工作發表。
爪蟾中細胞核移植的成功，直接導致了科學界和社會對「克隆」的關注。因為移植後的卵細胞具備了幹細胞的多能性，可成功地發育成一個新的個體，這個個體具備供體完整的遺傳信息，所以理論上，可以在供體存活期間，使用其分化的細胞（不影響供體的生存），製造與其遺傳信息完全一致的「克隆」。這樣的理論可行性及潛在的醫用價值，除了成為科幻電影和小說的題材，也引起了科學家的狂熱關注和社會對倫理的討論。
然而真正在哺乳動物中實現克隆，卻用了40年的時間。第一個克隆的哺乳動物，即是大家所熟悉的多莉羊。儘管沒有系統性的研究，早老和亞健康一直是圍繞著克隆動物的話題。多莉生前需要接受治療，並且於6歲半的時候死亡，而正常的羊可以存活10年。在今年7月份的報道中，曾經參與制造多莉的一批科研人員通過對更多的克隆羊，包括多莉的4個克隆，進行了長期和系統的檢測，發現體細胞核移植製造的克隆可以如同健康的羊一樣正常衰老，多莉的亞健康和早老可能只是一個例外。
幹細胞屢獲突破背後
隨著發育生物學的發展，除了受精卵，人們發現發育中或者已發育成熟個體的不同組織依然保留著、具備一定分化能力的「多能性」（pluoripotency）細胞。這類細胞雖不能像全能性的受精卵那樣分化成所有的組織細胞，卻也能分化成多種該組織的細胞，因此根據細胞來源，幹細胞可分為胚胎幹細胞和組織特異性幹細胞。在現代幹細胞概念的範疇里，受精卵即是一個全能性的幹細胞，可以預期的是對這些來源的幹細胞的研究和應用，都或多或少的會涉及倫理問題，尤其是人源胚胎幹細胞。
誘導去分化可以提供新的幹細胞來源，可以避免部分倫理問題。是否存在更為簡便的方式誘導去分化？體細胞核移植雖然可以製造幹細胞，卻有較高的技術難度，需要對供體和受體細胞進行破壞性的精細操作。日本科學家山中伸彌對該問題的研究成果直接導致了目前廣泛使用的新的幹細胞來源：由已分化細胞去分化產生的幹細胞（induced pluripotent stem cells，簡稱iPS細胞）。
山中伸彌首先使用伊萬建立的體外培養的胚胎幹細胞，鑒定了維持幹細胞多能性的因子。在此基礎上，他和他的學生們發現，只需要對細胞進行簡單的轉染，共表達4個轉錄因子，即可將已分化的細胞轉變為具有再分化能力的多能幹細胞。調控分子的發現以及簡單的實驗操作方式，引發了過去幾年裡科學界對誘導去分化幹細胞研究和臨床應用的狂潮。山中伸彌與戈登一起分享了2012年的諾貝爾生理學或醫學獎。
約翰·戈登（John Gurdon，左）、山中伸彌（Shinya Yamanaka，右）2012年獲諾獎。來源：The Nobel Foundation
生物科學研究的每一次名留史冊的突破，幾乎都源於對基礎生物學問題的好奇，以及對基礎科學研究的熱情。看似平凡無奇的生物，比如土壤中的線蟲，河岸邊的青蛙以及偷糧食的小鼠，都成為科學發現的源泉和人類社會醫療水平進步的推動力。這些關鍵問題的解決，成就了科學史上的英雄，他們傑出貢獻的背後是難能可貴的社會的支持和認可。
在幹細胞研究領域，全球科學家，60年間，實現了幹細胞從基礎到應用的一個又一個里程碑式的突破。這源於科學家對基礎科學問題孜孜不倦地探索，雖然它們與人類無直接關聯，但政府和社會的支持和鼓勵，營造了良好的科研支持環境，促使了幹細胞領域科學突破的發生，並培養出一代又一代對基礎生物學問題好奇、充滿熱情的年輕人。這樣的一群人，最終會推動人類探究自然以及醫療水平的進步。
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