60年三获诺奖，干细胞领域那些名垂青史的发现

知識 08-13

?人体胚胎细胞的分化过程，图片截取自Euro Stem Cell

编者按：

20世纪50年代，干细胞研究领域的弄潮儿陆续登场，彼时干细胞研究仍处在萌芽时期。随着细胞核移植等技术的发展，普通细胞也可重新逆转成为具有全能分化的干细胞。2006年，日本科学家山中伸弥仅通过四种细胞因子，即可将普通细胞逆转成干细胞，顿时让人眼前一亮。在对青蛙，小鼠和线虫的研究中，涌现出了许多杰出的科学家，他们出色的工作不仅赢得了多个诺贝尔奖，让我们得以窥探细胞生物学领域神奇的秘密，还带来了医疗技术革命：干细胞移植。

撰文 | 郭龙华（犹他大学、斯托瓦斯医学研究所）

责编 | 叶水送

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我们知道，受精卵在胚胎发育过程中产生众多形态以及功能特化的细胞，这一过程称为细胞分化。受精卵的这一特性，称为细胞的全能性（totipotency）。这可使其通过细胞分裂、分化，最终变成具有不同细胞类型、复杂多样的动物或植物。事实上，最经典、深入的受精卵分化以及细胞谱系研究是在线虫（Caenorhabditis elegans）中完成的。

线虫是生活在土壤里，透明的，大小仅约1毫米的线状小虫。由于它们身体透明、细胞数量适中，使得英国生物学家约翰·萨尔斯顿（John Sulston）仅通过显微镜观察，即可清晰地勾画出完整的、从单细胞（受精卵）到959个成体细胞的分化过程——这部分工作于1976年陆续发表。

?细胞分化研究的模式动物之一：线虫，图片来自uu.nl

2002年，萨尔斯顿因这一工作及对细胞死亡的研究，与他的导师悉尼·布伦纳（Sydney Brenner）以及美国生物学家罗伯特·霍维茨（H. Robert Horvitz）一同分享了诺贝尔生理学或医学奖。

?约翰·萨尔斯顿（John Sulston，右）2002年获诺奖。来源：The Nobel Foundation

「恐怖片」一样的发现

虽然胚胎发育过程中受精卵的分化早已被认识到，但在20世纪50年代，发育中或成体中的干细胞概念并没有确立，对细胞分化的理解也不够深入。最重要的发现源自于勒罗伊·史蒂文斯（Leroy Stevens）在小鼠同系繁殖（inbreeding）中的工作。有一天他发现品系129小鼠有着巨大的阴囊（scrotum），于是与技术员一起杀了几只这个品系的小鼠，发现在其精囊中有头发、牙齿和血管。这个如同「恐怖片」一样的发现，是干细胞研究史上的一个里程碑。史蒂文斯由此发现了畸胎瘤（teratoma）。

?Leroy Stevens（1920-2015）, 图片来自ellsworthamerican.com

在后续的工作中，他发现癌组织中的部分细胞可被移植到正常的小鼠身上，诱导畸胎瘤的发生。如果被移植到腹膜腔，这群细胞能够发育成胚状体（embryoid bodies），这是一种类似于胚胎的培养体。进一步研究发现，这些癌组织由原生殖细胞（primordial germ cell）发育而来。移植129品系小鼠的原生殖细胞、早期胚胎细胞到成体小鼠体内，同样能诱导畸胎瘤的形成。虽然没有直接的正常胚胎干细胞的研究予以佐证，但他于1954年发表的论文，预言了胚胎干细胞的多能性、分化以及自我复制的能力，奠定了胚胎干细胞研究的基础。

另外两位学者，比阿特丽丝·敏茨（Beatrice Mintz）和卡尔·伊尔门塞（Karl Illmensee）通过向正常小鼠的胚胎注射单个畸胎瘤干细胞，证明这些干细胞可分化为正常的体细胞和生殖细胞，胚胎期注射获得的成体小鼠没有畸胎瘤。马丁·伊万（Martin Evans）获得史蒂文斯馈赠的129品系后，进行体外畸胎瘤组织的培养、多能性和细胞分化研究，成功完成了129品系和正常小鼠胚胎期细胞内细胞团（inner cell mass）的体外培养和分化，并最终确定了胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell）的概念。

体外培养的胚胎干细胞可在移植后成功分化为生殖细胞和多种体细胞，并将它们的基因型传递到下一代。这一特性称为干细胞的多能性（Pluripotency），与受精卵的全能性相对应。因这项工作及其编辑小鼠目标基因的贡献，伊万与马里奥·卡佩奇（Mario R. Capecchi）、奥利弗·史密斯（Oliver Smithies）分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。

?马丁·伊万（Martin Evans，中）2007年获诺奖。来源：The Nobel Foundation

在1998年，使用小鼠中建立的原理，詹姆斯·汤姆逊（James Thomson）成功实现人胚胎干细胞的体外培养，获得社会媒体的高度关注。

一次著名的重复实验

同样是在20世纪50年代，另一部分学者在进行着完全相反的研究。已分化的成熟细胞是否能够重新获得类似于受精卵（或干细胞）的特性？细胞分化的过程是不是丢失了部分基因，抑或是抑制了这些基因的表达？这样的抑制机制是否可逆？

最早试图解决这个问题的是1935年的诺贝尔生理或医学奖获得者汉斯·斯皮尔曼（Hans Spemann）。他使用头发丝对蝾螈的受精卵进行精细地操作，证明4次分裂后的胚胎细胞的细胞核依然具备全能性。使用更晚期的胚胎细胞，甚至完全分化的细胞核，最著名的实验莫过于在青蛙中进行细胞核移植。这个实验仅分为两步：首先，取走卵细胞的细胞核，仅保留细胞质；其次，取出已分化的细胞核，并转移到卵细胞的细胞质中。

1952年，罗伯特·布里格斯（Robert Briggs）和托马斯·金（Thomas King）完成了在美洲豹蛙（Rana pipiens）中未受精卵细胞和已发育胚胎细胞之间的核移植，结果证实移植成功的卵细胞能够发育成正常的青蛙，但是他们同时也发现使用相对更晚期的胚胎细胞，移植后的卵细胞不能像正常受精卵一样获得全能性。他们推测，在胚胎发育过程中，细胞核可能丢失了部分基因，或者不可逆地抑制了部分基因的表达。英国科学家约翰·戈登（John Gurdon）在他博士导师米彻尔·菲施贝格（Michail Fischberg）的建议下，在非洲爪蟾（Xenopus laevis）中重复了该实验。有趣的是，戈登首先发现胚胎晚期的细胞核同样能够使得移植后的卵细胞获得全能性，从而推翻了布里格斯和金的结论。

?Michail Fischberg（1918-1998）, 图片来自dev.biologists.org

?左：美洲豹蛙；右：非洲爪蟾；图片来自wikipedia

随后戈登使用已完全分化的肠道表皮细胞的细胞核来最终确定已分化细胞核在移植后可以获得全能性。在其读博士后期间，菲施贝格和他的助理照顾着这群爪蟾直到成年。戈登建立自己的实验室后，他确定这些爪蟾能够产生正常的后代，从而用实验证明细胞分化过程中基因组没有发生变化，并且已抑制的基因表达可以被逆转，为诱导去分化（将分化细胞转变成干细胞）奠定了理论和技术基础。事实上，在不破坏细胞的情况下实现诱导去分化，大概又过了40年，直到日本科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）的工作发表。

爪蟾中细胞核移植的成功，直接导致了科学界和社会对「克隆」的关注。因为移植后的卵细胞具备了干细胞的多能性，可成功地发育成一个新的个体，这个个体具备供体完整的遗传信息，所以理论上，可以在供体存活期间，使用其分化的细胞（不影响供体的生存），制造与其遗传信息完全一致的「克隆」。这样的理论可行性及潜在的医用价值，除了成为科幻电影和小说的题材，也引起了科学家的狂热关注和社会对伦理的讨论。

然而真正在哺乳动物中实现克隆，却用了40年的时间。第一个克隆的哺乳动物，即是大家所熟悉的多莉羊。尽管没有系统性的研究，早老和亚健康一直是围绕着克隆动物的话题。多莉生前需要接受治疗，并且于6岁半的时候死亡，而正常的羊可以存活10年。在今年7月份的报道中，曾经参与制造多莉的一批科研人员通过对更多的克隆羊，包括多莉的4个克隆，进行了长期和系统的检测，发现体细胞核移植制造的克隆可以如同健康的羊一样正常衰老，多莉的亚健康和早老可能只是一个例外。

干细胞屡获突破背后

随着发育生物学的发展，除了受精卵，人们发现发育中或者已发育成熟个体的不同组织依然保留着、具备一定分化能力的「多能性」（pluoripotency）细胞。这类细胞虽不能像全能性的受精卵那样分化成所有的组织细胞，却也能分化成多种该组织的细胞，因此根据细胞来源，干细胞可分为胚胎干细胞和组织特异性干细胞。在现代干细胞概念的范畴里，受精卵即是一个全能性的干细胞，可以预期的是对这些来源的干细胞的研究和应用，都或多或少的会涉及伦理问题，尤其是人源胚胎干细胞。

诱导去分化可以提供新的干细胞来源，可以避免部分伦理问题。是否存在更为简便的方式诱导去分化？体细胞核移植虽然可以制造干细胞，却有较高的技术难度，需要对供体和受体细胞进行破坏性的精细操作。日本科学家山中伸弥对该问题的研究成果直接导致了目前广泛使用的新的干细胞来源：由已分化细胞去分化产生的干细胞（induced pluripotent stem cells，简称iPS细胞）。

山中伸弥首先使用伊万建立的体外培养的胚胎干细胞，鉴定了维持干细胞多能性的因子。在此基础上，他和他的学生们发现，只需要对细胞进行简单的转染，共表达4个转录因子，即可将已分化的细胞转变为具有再分化能力的多能干细胞。调控分子的发现以及简单的实验操作方式，引发了过去几年里科学界对诱导去分化干细胞研究和临床应用的狂潮。山中伸弥与戈登一起分享了2012年的诺贝尔生理学或医学奖。

?约翰·戈登（John Gurdon，左）、山中伸弥（Shinya Yamanaka，右）2012年获诺奖。来源：The Nobel Foundation

生物科学研究的每一次名留史册的突破，几乎都源于对基础生物学问题的好奇，以及对基础科学研究的热情。看似平凡无奇的生物，比如土壤中的线虫，河岸边的青蛙以及偷粮食的小鼠，都成为科学发现的源泉和人类社会医疗水平进步的推动力。这些关键问题的解决，成就了科学史上的英雄，他们杰出贡献的背后是难能可贵的社会的支持和认可。

在干细胞研究领域，全球科学家，60年间，实现了干细胞从基础到应用的一个又一个里程碑式的突破。这源于科学家对基础科学问题孜孜不倦地探索，虽然它们与人类无直接关联，但政府和社会的支持和鼓励，营造了良好的科研支持环境，促使了干细胞领域科学突破的发生，并培养出一代又一代对基础生物学问题好奇、充满热情的年轻人。这样的一群人，最终会推动人类探究自然以及医疗水平的进步。

参考文献：

1、http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/12717/title/A-Stem-Cell-Legacy--Leroy-Stevens/

2、Stevens, L. C. & Little, C. C. Spontaneous Testicular Teratomas in an Inbred Strain of Mice. Proc Natl Acad Sci U S A 40, 1080-1087 （1954）.

3、Mintz, B. & Illmensee, K. Normal genetically mosaic mice produced from malignant teratocarcinoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A 72, 3585-3589 （1975）.

4、Illmensee, K. & Mintz, B. Totipotency and normal differentiation of single teratocarcinoma cells cloned by injection into blastocysts. Proc Natl Acad Sci U S A 73, 549-553 （1976）.

5、Shamblott, M. J. et al. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 13726-13731 （1998）.

6、Thomson, J. A. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147 （1998）.

7、Briggs, R. & King, T. J. Transplantation of Living Nuclei From Blastula Cells into Enucleated Frogs" Eggs. Proc Natl Acad Sci U S A 38, 455-463 （1952）.

8、King, T. J. & Briggs, R. Changes in the Nuclei of Differentiating Gastrula Cells, as Demonstrated by Nuclear Transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A 41, 321-325 （1955）.

9、Gurdon, J. B. The egg and the nucleus: a battle for supremacy. Development 140, 2449-2456 （2013）.

10、Gurdon, J. B., Elsdale, T. R. & Fischberg, M. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature 182, 64-65 （1958）.

11、Gurdon, J. B. Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells. Dev Biol 4, 256-273 （1962）.

12、Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A. & Wilmut, I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380, 64-66 （1996）.

13、Sinclair, K. D. C., S.A.;Gutierrez,C.G.;Fisher,P.A.;Lee,J.H.;Rathbone,A.J.;Choi,I.;Campbell,K.H.S.;Gardner,D.S. Healthy ageing of cloned sheep. NATURE COMMUNICATIONS （2016）.

14、Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 （2006）.

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