盤點基因編輯新利器

CRISPR-Cas9技術的局限性促使研究人員尋找替代方法

Argonaute蛋白模型圖片來源：Laguna Design/SPL

CRISPR-Cas9工具讓科學家幾乎能隨意改變基因組。人們稱讚它比以往的技術明顯更簡單、更廉價及更通用。CRISPR-Cas9在全球各地的實驗室中大放光彩，並帶來了一些醫學和基礎研究的新應用。

但該技術也有其局限性。美國加州大學聖地亞哥分校生物工程師Prashant Mali指出，它擅長到基因組的一個特定位點，並在那裡完成切割。「但有時候你感興趣的應用還要多一點。」

今年年初，研究人員懷著熱情撲向了一種名為NgAgo的新基因編輯系統。這也顯示了他們對CRISPR-Cas9存在不滿，以及尋找替代方法的強烈動機。哈佛大學醫學院遺傳學家George Church說：「這暗示了每種新技術是多麼的脆弱。」

NgAgo只是不斷擴大的基因編輯工具庫中的一員。在該工具庫中，有些是CRISPR的變體，另一些則為編輯基因組提供了新途徑。

迷你版Cas9

或許有一天，CRISPR-Cas9會被用來改寫導致遺傳疾病的一些基因。但這一系統的組件——Cas9酶和引導其到達目標序列的一段RNA過大，無法填塞到基因治療最常用病毒的基因組中並將外源遺傳物質運送到人類細胞中。

從葡萄球菌中取得的迷你Cas9形式是一種解決方案。它非常小，可以硬塞進當前市場上基因治療採用的病毒中。去年12月，兩個研究小組利用迷你Cas9在小鼠中糾正了導致杜氏肌營養不良的基因。

擴大範圍

Cas9不會到處進行切割——某一DNA序列必定存在於切割位點附近。這一要求在許多基因組中很容易得到滿足，但對於一些實驗來說可能是令人痛苦的限制。研究人員正在尋找一些微生物提供有著不同序列要求的酶，這樣便可以擴大能夠改造的序列數量。

這樣的一種酶Cpf1，可能成為有吸引力的替代品。比Cas9更小的Cpf1有不同的序列要求，且高度特異。另一種叫作C2c2的酶，靶向RNA而非DNA——這一特徵有潛力用於研究RNA及利用RNA基因組對抗病毒。

真正的編輯器

許多實驗室只利用了CRISPR-Cas9刪除基因的一部分，由此破壞其功能。Church說：「人們想將這樣的編輯宣布為勝利，但燒掉書的一頁並不等於編輯了這本書。」

那些想用一段序列交換另一段序列的研究人員，則面對著一個更艱難的任務。當Cas9切割DNA時，細胞往往會在縫合斷裂端時生成一些錯誤。這可以造成許多研究人員想要的缺失。

想要改寫一段DNA序列的研究人員，依賴於可以插入新序列的不同修複信號通路——發生這一過程的頻率比容易出錯的縫合要低得多。明尼蘇達大學植物學家Daniel Voytas說：「每個人都說，未來或能一次編輯多個基因，而我認為：『我們現在甚至無法高效編輯一個基因。』」

但過去幾個月里的一些進展給Voytas帶來了希望。在今年4月，研究人員宣布他們讓Cas9喪失功能，將其與可將一種DNA鹼基轉變為另一種DNA鹼基的酶連接在了一起。喪失能力的Cas9仍然靶向它的嚮導RNA指定的序列，但無法進行切割：其連接的酶轉變了DNA鹼基，最終將此處的C鹼基轉變成了T鹼基。近日，發布在《科學》雜誌上的一篇論文報道了類似結果。

Voytas等人希望連接其他使得Cas9喪失功能的酶將生成不同的序列改變。

追逐Argonaute

今年5月，發表在《自然—生物技術》雜誌上的一篇論文推出了一個全新的基因編輯系統。研究人員稱，他們能夠利用一種叫作Argonaute的蛋白無需嚮導RNA或一段特定的鄰近基因組序列，可在預定位點切割DNA。轉而他們採用了對應靶區域的一段短DNA序列編程了Argonaute蛋白。

這一研究發現引發了關於CRISPR-Cas9將被取代的興奮與猜測，但一些實驗室迄今為止無法重現這些結果。韓國首爾國立大學基因組工程師Jin-Soo Kim提到，即便如此，來自其他細菌的Argonaute仍有望提供一條前進的道路。

編程一些酶

另一些基因編輯系統也在準備中，儘管有些已徘徊多年。在一個大型細菌研究計劃中，Church的實驗室並沒有觸及CRISPR，而是依靠了一種叫作lambda Red的系統，無需嚮導RNA可以編程lambda Red以改造DNA序列。然而，儘管該實驗室已開展了13年的研究，lambda Red還是只能在細菌中起作用。

Church等人表示，實驗室也正在致力於開發整合酶和重組酶，用作基因編輯器。 「通過利用酶的多樣性，我們可以生成更強大的基因組編輯工具箱。我們必須繼續探索這些未知的事物。」

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