科學家用混合方法了解細胞動態與功能

RNA聚合酶 圖片來源：美國斯坦福大學

與其他結構生物學家一樣，Eva Nogales趕上了好時機。這位美國加州大學伯克利分校的教員現在可以利用新工具，解決幾年前根本無法解答的細胞分子機制問題。

最近，Nogales和同事、分子生物學家、CRISPR-Cas9的聯合發明人Jennifer Doudna、的合項目正是個好例子。她們都對R環十分感興趣。很多情況下，在DNA被CRISPR-Cas9剪切前，細胞內會形成一個由核苷酸構成的R環。Nogales等人對化膿性鏈球菌中的R環進行了成像，得到了近原子解析度的結構圖像，提示了Cas9酶在特定位點如何打開DNA，並使其可用於CRISPR的分子剪刀。

這項工作最突出的是科學家能快速地將功能與結構聯繫起來，而且他們能把成像方法結合起來。一個多世紀以來，結構生物學的首選方法一直是X射線晶體衍射法。但有些生物分子太大或太小，難以結晶，因此不能採用X射線法。而且，一些分子在發揮功能時，會發生形態或朝向的變化，而結晶法無法捕捉這些變化。

現在，科學家擁有一個龐大的成像工具庫。低溫電子顯微鏡或化學家的核磁共振（NMR）成像等方法，都能在不結晶的情況下，獲得接近原子解析度的結構圖像，從而揭示分子的形狀、大小和方向。但並非所有方法對活細胞內的全部蛋白質、核酸都有用。

經驗證明，沒有一個單一的方法足以探討細胞中發生的動態行為和複雜的相互作用。最好的解決辦法是整合來自多個工具的圖像。

這種方法得到了諸多追隨者。斯坦福大學結構生物學家Roger Kornberg指出，每個方法都能提供一些重要信息，結合起來，就能實現1+1>2的效果。由於在揭示基因轉錄機制方面的貢獻，Kornberg於2006獲得了諾貝爾化學獎。對於這一突破性研究，他使用的是X射線晶體衍射法。現在，和其他晶體學家一樣，他開始使用多種方法的結合。

Kornberg繼續分析RNA聚合酶II，但現在他把冷凍電鏡和晶體學技術結合起來。與晶體技術相比，冷凍電鏡可用於不易結晶的生物分子，並且能解析較大的分子，但目前解析度則稍遜一籌。Kornberg實驗室還使用化學交聯和質譜法，揭示鄰近蛋白質之間的關係以及利用已知蛋白質信息進行同源性建模。

同時，Nogales和Doudna團隊也使用混合方法研究R環。Nogales表示，「高解析度的X射線晶體法無法解析完整的R環結構。」所以他們用冷凍電鏡在低解析度上對完整的環結構進行解析。只有把兩者結合起來，研究人員才能真正揭示CRISPR-Cas9中R環的作用。

這種混合或綜合性方法有助於研究人員深入研究基礎科學問題，對藥物開發者也非常有用。細胞膜上的大蛋白質往往是治療靶標，高解析度混合方法能揭示藥物與受體相互作用的原子細節。同樣，通過展示艾滋病病毒、埃博拉病毒和其他病原體的包膜蛋白與免疫細胞相互作用機制，能有助於疫苗發展。納什維爾范德堡大學結構生物學家Jens Meiler表示，這些結構對人們理解免疫系統的工作機制非常重要。

Noglaes總結到：「這是混合方法的黃金時代。」

夢想成真

德國歐洲分子生物學實驗室(EMBL)細胞生物和生物物理部主任Jan Ellenberg表示，這個時代對很多生命科學家來說，是夢想成真的時代。這個夢想是從原子層面無縫銜接到細胞層面。針對細胞大分子的深入理解自然能解答結構生物學的首要問題：一個分子的結構是怎麼和其功能聯繫在一起的?

結構生物學家工具箱中的每種技術都提供了不同的視角。生物學家相信，使用混合方法構建的模型可以準確地反映分子或複合體在細胞中的行為。Meiler說：「你需要把這些技術結合起來，才能得到全面答案。」

X射線晶體衍射一直是確定蛋白質原子結構的標準方法。在成立於1971年的蛋白質數據銀行擁有的大約12萬個模型中，約有90%來自晶體學研究。

不過，對於結構生物學家而言，該技術雖然解析度高，但也有局限性。首先，樣品要高度純化，以產生有序的晶體。科學家通過分析原子如何散射光確定分子結構。該技術需要有足夠的原子，以產生可測量的衍射圖案，並且每一個晶體必須是靜態的。因此，該方法不能揭示一個分子是如何運動的以及如何起作用的，也不能揭示它如何與其他系統互動。

德國複雜系統研究所計算結構生物學小組組長Gunnar Schroder指出，蛋白質不僅僅是一個單一的靜態結構，「通常情況下，你想看到的是整個蛋白質如何工作」。Schroder使用混合方法理解蛋白的行為和彼此間的聯繫。晶體技術能提供蛋白在脫離正常環境時的快照。但結構生物學家需要其他方法補充晶體結構信息，並提高他們對蛋白質形態和功能的理解。

此外，許多蛋白質，例如細胞膜上的藥物靶點，是靈活而不穩定的。為了讓這些蛋白質形成晶體，研究人員經常要在某種程度上改變它們。Meiler指出，改變樣本可能無法準確反映分子的原生態以及其在細胞內的排布方式。他把實驗和計算方法結合，以便更好地理解分子結構。「晶體法是很好的初始方法，但這個方法不足以提供功能方面的信息。」他說。

幫個小忙

Nogales等人使用的混合策略達到了10埃的整體解析度，相比於以往分析的30埃解析度是極大的進步。解析度的提高帶來了新視角，正如Nogales所說，「我們可以看到氨基酸與DNA的相互作用」。

但冷凍電鏡要求標本被冰凍。這並不理想，因為冷凍的樣本遠遠脫離了自身動態、天然的狀態。而核磁共振光譜可以解決這個問題。Schroder表示，「核磁共振有一個很大的優勢，你可以在室溫下觀察樣本，蛋白質的動態信息。」他的實驗室通過整合NMR、冷凍電鏡和晶體學數據，建立實驗模型。

NMR於20世紀40年代被首次應用到實驗中。研究人員在外部磁場中激發原子得到大分子結構。當原子恢復後，其內部磁場的變化可以被檢測到，從而反映出分子的原子結構。然而，核磁共振光譜只適用於相對較小的大分子或複合體。

結構生物學家也使用混合方法解析超大複合體——這是過去無法完成的任務。Kornberg最新的成果進一步拓展了其對RNA聚合酶II的研究，並使用混合方法描述了一個由50多個蛋白質和轉錄因子組成的巨大複合體。「通過多個方法的結合，他們首次看到了整個複合體。每個方法的貢獻同樣大。」他說。

仍有缺點

雖然不同的方法能帶來更多信息，但混合也會造成錯誤的疊加。因此，混合方法的一個潛在問題是，多個錯誤來源造成的誤差增加。Meiler指出：「我關注的是如何在整合方法的同時，減小誤差，保證得到的模型具有準確性、精度和可靠性。」

另一個障礙是多類數據集的共享和利用。任何一個技術都能得到豐富的信息，因此信息共享是個挑戰。冷凍電鏡生產商FEI公司的首席科學家Jeffrey Lengyel表示，「每天都能生成百萬兆位元組的數據」。他希望，結構生物學領域可以向高通量的遺傳生物學領域學習處理數據超載的方法。雖然有能靈活結合高解析度晶體結構數據和冷凍電鏡圖的軟體，但其他方法得到的數據無法簡單地混合。例如，電子順磁共振光譜測量高分子的距離和方向，而冷凍電鏡產生密度圖。雖然這兩種數據結合在一起非常有用，但這兩種數據語言並不相同。Meiler提出疑問，「我如何整合這些數據，如何分享?」

為了探討數據組織、共享和使用的最佳方式，幾十名結構生物學家於2014年10月齊聚英國歐洲生物信息研究所。Schroder表示，目前，PDB存儲單個蛋白結構的數據，應該增加蛋白質所有方面的數據。細節越豐富，越有助於全面解析蛋白和大分子功能。

學界已經做出了一些努力：目前已建立二維電子顯微鏡圖像檔案庫和三維的EMDataBank。這些檔案庫由EMBL等機構提供資金，其中包含的數據可以共享、歸檔和分發。

另一個可能阻礙該領域的威脅是專業知識。Meiler指出，「技術需要投資，但在培訓科學家上進行投入也非常重要。」他建議，結構生物學領域的學生都去學習每一種方法的優缺點，並至少精通一種方法。「我們需要培養新一代科學家理解如何整合這些不同的技術。」

最後，結構生物學家必須學會提問題，提出新的、複雜的、以前被認為不可能的生物問題。Ellenberg還表示，多虧混合方法，「很多5年前我甚至以為直到退休都沒法探索的問題能解決了」。

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