Science「力挺」Nature：新型「魔剪」CRISPR，僅「改寫」單個核苷酸！

生物探索

編者按

CRISPR系統是目前生命科學領域最熱門的技術之一。全球科學家也在積極推進基於這一技術的臨床試驗，希望能夠將其用於解決人類健康問題。然而，這一系統的轉化應用仍需克服脫靶效應等技術限制。近日，發表了在Science上的一項研究中，日本神戶大學的科學家們開發了一種新型CRISPR系統，可對單個核苷酸進行修改，實現更精準的基因編輯。

8月4日，發表在《科學》（Science）雜誌上的這項研究中，日本神戶大學的Akihiko Kondo教授帶領的科學家小組通過將一種被修飾過的Cas9酶與來源於七鰓鰻（sea lamprey）免疫系統中一種酶結合，找到了編輯單一DNA核苷酸的新方法。

簡單來說，利用脫氨酶，研究人員創建了一種修改版的CRISPR/Cas9。這種新版本的系統能夠避免有害的雙鏈切割，最小化CRISPR/Cas9技術引入的附帶突變（collateral mutation），並且，不需要添加DNA模板。

Akihiko Kondo 教授

（圖片來源：http://www.csrs.riken.jp/en/labs/cfrt/index.html）

目標：創建更精準的基因編輯工具

藉助傳統的CRISPR/Cas9系統，研究人員是通過引入Cas9酶到細胞中編輯DNA序列，從而產生雙鏈切割；同時，細胞會利用引入的DNA模板修復缺口。這一編輯過程是依賴細胞的同源重組機制，但包括非同源性末端接合（NHEJ）在內的其它機制會阻礙修復過程，常常導致不必要的、不精確的插入和刪除。

為了創建一個更加精準的工具，Kondo和他的同事選擇了兩種修飾過的Cas9，分別與來自七鰓鰻的激活誘導胞嘧啶核苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase ，AID）進行了融合。一種是核酸酶失活版Cas9（nuclease-dead Cas9），這種版本的Cas9不能夠「切開」雙鏈DNA；另一種是切口酶版Cas9（nickase Cas9），這種版本的Cas9能夠產生一個缺口，即切割DNA單鏈。

AID的作用通常是會使免疫球蛋白和抗體基因產生突變，形成免疫系統的多樣性。具體來說，AID只對單鏈DNA發揮作用，能夠將胞嘧啶(C)替換為尿嘧啶(U)。

驗證：兩種新型複合物是否有效

Complex formation of dCas9-gRNA and PmCDA1 induces targeted mutation

兩種系統都「很好」

研究人員在缺乏內生AID樣系統（AID-like system）的芽殖酵母中驗證了這兩種新型複合物的基因編輯能力。結果發現，當蛋白質複合物藉助嚮導RNA靶向CAN1基因時，CAN1的突變頻率比「非靶向」的基因增加了1000倍。

通過全基因組測序，研究人員發現，這種方法帶來的脫靶突變很少。該研究的第一作者Keiji Nishida說：「這種脫靶突變率是可以接受的，比自然的背景突變率（natural background mutation rate）高不到10倍」。

研究人員還證明，將兩種不同的導向RNAs和Cas9-AID複合物一起表達，能夠同時「編輯」兩個基因。這一基因編輯複合物在哺乳動物細胞系中也能發揮很好的效果，導致相對較少的脫靶突變。

此外，在酵母中，與表達標準CRISPR/Cas9系統的細胞相比，表達這兩種基因編輯複合物的細胞都生長的更好。這一結果表明，這種新的基因編輯工具毒性也更低。

誰更好？

科學們還發現，與「nuclease-dead Cas9-AID」複合物相比，「nickase Cas9-AID」複合物的基因編輯效率略高些。它是在發生核苷酸替換相反的DNA鏈上創建一個小「缺口」。

是否能更好？

為了進一步修飾，研究人員將Cas9-AID這一複合物與另外一種酶（尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑）聯繫起來。這種酶的「加入」增加了Cas9-AID複合物形成「C to T」替換，以及最小化無意缺失突變產生（在哺乳動物細胞系中）的效率。

回顧：Nature曾發表類似技術首項研究

事實上，這是關於編輯單個鹼基的CRISPR系統的第二篇報道。

2016年4月20日，發表在Nature上的一項研究中，哈佛大學化學生物學教授David Liu帶領的研究小組利用不同的脫氨酶（來自大鼠）率先發表了相似的技術。科學家們報告稱，一種經改造的CRISPR基因編輯系統能夠賦予研究者們有效改變給定基因中單個DNA鹼基的能力。

近幾年，CRISPR/Cas9基因編輯系統被全球科學家們廣泛應用，然而儘管很容易用它改變基因的功能，但是修復點突變一直是個未解的難題。Liu說：「這些點突變非常重要。事實證明，大多數與遺傳變異相關的疾病都是點突變。」

對於Science發表的這一成果，他表示：「當一個重要的發現被重複時，對一個領域是很大的鼓舞，也會幫助領域的繼續發展。」

兩種技術的對比

Science上發表的這一Cas9-AID複合物系統被命名為Target-AID複合物。它具有很高的特異性，能夠對目標基因中3到5個鹼基對窗口（window）內的胞嘧啶(C)進行修改。

Liu表示，他們對突變窗口（mutation window）如此窄非常驚訝。相比之下，他的團隊報告的基因編輯系統能夠作用的突變窗口介於3-6個核苷酸之間。

他說：「要想發揮最大的作用，這種鹼基編輯窗口不能太寬，也不能太窄。因此，這兩種方法可以給研究人員更多的選擇。」

展望：如何「走向」臨床？

哈佛大學的遺傳學大牛George Church表示，這些脫氨酶解決了大部分先前已有的基因編輯方法（包括TALENSs、ZFN和Cas9）存在的最大問題，即真正所需的 「基因編輯」會與通過NHEJ機制產生的隨機插入和刪除存在競爭。此外，這種基於脫氨酶的系統還降低了雙鍵切割帶來的毒性。

開發這種工具臨床應用的一個關鍵問題是，進一步檢查突變脫靶效應。另一個需要考慮的問題是，如何特異性的靶向目標序列中的單個「C」，而不影響鄰近的「C」。

Kondo表示，他的團隊將開展進一步的工作，將Cas9與其它酶進行結合，創建一個全系列的DNA編輯工具包，實現4個核苷酸替換之間的任意組合。

備註：本文部分內容編譯自The-scientist，原標題「CRISPR: NoCutting Required」。

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