改進基因測序方法 有效簡化基因建庫儀器配置

【中國化工儀器網 技術前沿】導讀：該技術操作簡單靈活、檢測成本低、檢測通量高，更易被科研人員掌握並能在通用分子實驗室中實現，特別適用於需要對大量個體進行SNP標記開發及分型的遺傳圖譜構建、系統發育分析及群體遺傳學等研究。

在二代測序基礎上發展起來的RAD-seq技術是一項基於全基因組酶切位點的簡化基因組測序技術。由於特異性酶切位點在全基因組範圍內廣泛分布，通過RAD-seq能夠在大多數物種內獲得數萬至數十萬的單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)標記。在此基礎上，RAD-seq技術又衍生出多種簡化基因組測序方法，包含GBS，ddRAD，ezRAD以及2b-RAD等。其中，ddRAD-seq通過一個稀有酶與一個常見酶相結合對基因組DNA進行雙酶切，免去隨機打斷的過程，是一種非常有前景的簡化基因組測序技術。不過，ddRAD技術雖然在建庫流程上比RAD做了一定程度的簡化，但仍然包括12步，實驗耗時較長。因此，有必要對現有的ddRAD簡化基因組測序文庫構建方法進行改進，以克服其需要多次選酶、使用儀器複雜、成本偏高等缺陷，提高測序效率。

MiddRAD(a)與ddRAD(b)實驗流程圖

中國科學院昆明植物研究所博士研究生楊國騫在研究員郭振華與李德銖指導下，與中科院海洋研究所李莉研究組一起，開發出一種被子植物中通用的雙酶切簡化基因組(ModifiedddRAD，簡稱MiddRAD)二代測序文庫構建方法。該方法首先發現一種被子植物通用酶切組合「AvaIIMspI」，減少了不同物種間需要多次選酶的步驟;其次，該方法將複雜的建庫專用儀器優化為通用的分子生物學儀器;再次，該方法將P1測序接頭由37個鹼基簡化為25個鹼基(barcode按5個鹼基計算)並設計出一套新的barcode-adapter體系;最後，該方法還減少了純化酶切產物、連接前定量及混樣後純化連接產物的步驟，簡化了建庫流程，允許僅使用50ngDNA即可完成文庫構建。該技術操作簡單靈活、檢測成本低、檢測通量高，更易被科研人員掌握並能在通用分子實驗室中實現，特別適用於需要對大量個體進行SNP標記開發及分型的遺傳圖譜構建、系統發育分析及群體遺傳學等研究。因此，MiddRAD-seq在農業分子育種、進化生物學和保護生物學等領域具有良好的應用價值和推廣前景。

研究以DevelopmentofauniversalandsimplifiedddRADlibrarypreparationapproachforSNPdiscoveryandgenotypinginangiospermplants為題發表於PlantMethods上。

該研究得到國家自然科學基金項目(31470322、31430011)的支持。

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