能力驗證及實驗過程分享
作者：夏天的雪
原標題：不期而遇的能力驗證及實驗過程分享
１前言
報名參加儀器信息網主辦的「草根能力比對之37期：
果汁中的苯甲酸含量測定」的樣品到了，同時年初報名參加的「醬油中山梨酸、苯甲酸測定」的能力驗證樣品也到貨了，一天收到兩份比對樣品外加手頭的一堆樣品，小夥伴們又得忙開了，值得慶幸的是兩份能力驗證樣品都需要測定苯甲酸而且樣品前處理方法都差不多，兩者實驗並不是很衝突，可以一塊解決。
接到樣品，分別檢查樣品包裝的完整性，保存條件、樣品編號並仔細研讀作業指導書等附屬資料。
苯甲酸和山梨酸的檢測是實驗室的常規檢測項目，醬油和水果汁也是常見實驗樣品，於是先依據GB/T 23495-2009方法進行樣品前處理，採用實驗室現有的標準溶液和色譜條件進行測定：
一方面是測算一下樣品中待測組分的濃度以確定標準曲線範圍；
另一方面檢查色譜條件或者樣品前處理條件是否合適，是否會存在干擾或者分離不好的情況。
２實驗部分
實驗方法參考GB/T23495-2009
２.１樣品前處理
依據檢測結果報告單的要求，分別採用稱重和量取體積的方式對醬油和水果汁樣品進行取樣。稱取約2.5g醬油樣品（準確吸取2.０mL水果汁樣品）於25mL容量瓶中，分別加入2mL亞鐵氰化鉀（0.25mol/L）和2mL乙酸鋅（1.0mol/L），搖勻，加水定容至刻度後轉移至50mL離心管中，4000r/min離心5min，取上清液，經0.22μm濾膜過濾後進樣分析。
２.２儀器分析條件
色譜柱：Ultimate XB-C18 (250mm×4.6mm, 5μm)；流動相：甲醇：乙酸銨（0.20mol/L）=5：95；流速：1.0mL/min；進樣體積：10μL；柱溫：30℃；檢測波長：230nm
２.３色譜條件優化
測試結果表明，水果汁樣品干擾較少，樣品中苯甲酸的濃度約為110mg/L；醬油樣品較為複雜，在待測組分苯甲酸附近有干擾峰存在，採用原來的色譜條件進行測試時苯甲酸與干擾組分不能完全分離，從而影響苯甲酸的積分，最終會影響定量結果，因此需要先優化色譜條件，待組分完全分離後再定量。
優化色譜條件，從簡單的開始做起，先改變一下流動相比例，將甲醇和乙酸銨的比例改為2：98，重新進樣並檢查各組分保留時間的變化。
在反相色譜中，各組分之間由於物理性質和或化學性能的差異，改變流動相中有機相比例適當調節流動相的極性通常能夠影響各組分的保留時間，從而引起組分的分離，當甲醇和乙酸銨的比例改為2：98時，各組分的保留時間均延後，苯甲酸、山梨酸與干擾組分完全分離，因此決定採用該比例的流動相進行測定，在保證分離度的前提下犧牲點做樣時間。
由於水果汁中苯甲酸附近不存在雜質干擾問題，改變色譜條件也不會影響其測定，因此決定採用相同的色譜條件進行兩組比對樣品的測定，這樣可以避免重複測定苯甲酸的標準曲線。計算得到醬油樣品中苯甲酸的濃度約為0.6~0.8g/kg，山梨酸的濃度約為0.2~0.3g/kg。
２.４水果汁樣品前處理條件優化
觀察水果汁樣品較為澄清透明，色譜圖中也無明顯的干擾組分，於是決定嘗試採用直接進樣和稀釋後進樣（不加沉澱劑）的方式對水果汁樣品進行測試（上機前均需過0.22μm濾膜），測定結果如下：
直接進樣時，水果汁樣品中苯甲酸的濃度不是很高，在色譜柱的耐受範圍內，沒有出現拖尾、平頭峰等異常情況，峰型尚可，也無雜質干擾，因此決定採用直接進樣的方式對水果汁比對樣品進行測試，減少取樣、稀釋過程的誤差。醬油樣品中色素和雜質較多，直接或稀釋後進樣可能會導致色譜柱污染，篩板或者在線過濾器堵塞等故障，因此仍然採用原先方法進行樣品前處理。
２.５方法回收率測試
在樣品前處理方法和色譜條件確定之後，考察方法的回收率。
稱取2.5g左右醬油樣品，往樣品中加入一定量的苯甲酸和山梨酸的混合標準溶液並按照上述方法前處理後進行測試；同時準確吸取2mL水果汁樣品，往樣品中加入一定量的苯甲酸標準溶液稀釋到25mL後進行測試，考察方法的回收率，結果表明，醬油樣品中苯甲酸和山梨酸的回收率分別為96.74%和100.98%，水果汁樣品中苯甲酸的回收率為99.68% 。
２.６儀器重複性和精密度測試
分別對標準溶液、醬油樣品、水果汁樣品進行重複測定5次，考察儀器的重複性和精密度。結果表明，儀器具有很好的重複性，標準溶液和樣品中的苯甲酸、山梨酸的保留時間和峰面積的RSD都小於1%。
２.７標準曲線及線性相關性
以上測定過程中使用的標準溶液均是由實驗室之前配製的標準儲備液稀釋而來，雖然是按照規定條件進行保存，但是面對能力驗證還是需要格外謹慎的，防止在保存過程中濃度發生改變，於是決定重新配製標準溶液。另外此次草根比對提供了苯甲酸固體標準品，實驗室儲備的是液體的標準溶液，實驗之前先比較兩者濃度的準確性是否一致。
比較方法如下：
先將固體標準品配製成濃度為１000μg／mL的標準儲備液，然後與實驗室儲備的液體標準溶液稀釋到相同的、合適的濃度進行測定，比較兩者的峰面積，結果顯示兩者的結果非常相近，表明兩者的濃度是一致的，任選其一都不會影響實驗結果。在確保前處理方法具有較好回收率和儀器穩定的情況下，按照上述色譜條件對新配的系列標準溶液重新進行測定並繪製標準曲線。苯甲酸和山梨酸的線性相關係數(R2)分別為0.99968和0.99969。
經過上述一系列的前期測試，在驗證了方法的可行性和儀器的穩定性後，重新按照檢測結果報告單要求（醬油樣品為2個平行，水果汁樣品為8平行）進行樣品前處理並測試，測試完成後計算結果、按要求填寫檢測結果報告單、簽字蓋章並上交結果，到此能力驗證才告一段落。
3 小結
（1）同為液體樣品，能力驗證提供的樣品密封性較好，在瓶口多了一層封口膜，草根比對提供的樣品瓶中沒有封口膜，容易造成樣品的滴漏；
（2）能力驗證提供的樣品比較充裕，草根比對提供的樣品量較少，而且要求8個平行，幾經折騰樣品量已經消耗殆盡；
（3）草根比對在提供樣品的同時提供了苯甲酸標準品，實驗室不會因為沒有標準品而措手不及。同時採用相同的標準品測試樣品可以減少外界因素的影響，可以更多的考察操作過程和儀器的準確性。
（4）從醬油樣品測定的色譜條件優化過程可以看出，改變流動相中有機相的比例不僅會改變個組分的保留時間，同時各組分間的出峰順序也可能發生改變，例如苯甲酸與其干擾物的出峰順序發生了變化；
（5）本次實驗過程中水果汁樣品嘗試了稀釋進樣和直接進樣的方式進行測定，該方法不可輕易嘗試，需要依據樣品狀況而定，例如醬油樣品中色素和雜質組分較多，採用上述方法可能會造成色譜柱污染，篩板堵塞等故障。
（6）能力驗證樣品在測試前需要仔細閱讀作業指導書和檢測結果報告單，了解樣品提供者對測試方法、測試結果和完成日期的要求。
以上是個人的一點心得和實驗小結，歡迎各位提出寶貴意見！
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