顏寧研究組在《自然》發表論文 報道首個真核電壓門控鈣離子通道近原子解析度三維結構

2016年9月1日，生命中心顏寧研究組在《自然》（Nature）雜誌發表題為《電壓門控鈣離子Cav1.1通道3.6埃解析度結構》（Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1.1 at 3.6 angstrom resolution）的研究長文（Research Article），報道了首個真核電壓門控鈣離子通道的近原子解析度三維結構，為理解為數眾多的具有重要生理和病理功能的電壓門控鈣離子和鈉離子通道的工作機理奠定了基礎。

電壓門控離子通道是一大類位於細胞膜上、通過感受電信號控制離子跨膜進出細胞的蛋白質。上世紀四五十年代，英國科學家霍奇金和赫胥黎發現了動作電位；之後發現電壓門控鈉離子通道（Nav通道）引發動作電位，而電壓門控鉀離子通道（Kv通道）則能使細胞去極化，恢復至靜息電位。五十年代，科學家發現在沒有鈉離子的情況下，依賴鈣離子也能產生動作電位，這是由電壓門控鈣離子通道（Cav通道）介導的生理過程。鈣離子本身是細胞內信號傳遞的第二信使，通過Cav通道，將細胞膜兩側的電信號變化轉變為細胞內部的化學信號，引起一系列反應，包括肌肉收縮、腺體分泌、基因轉錄、細胞凋亡、神經遞質的傳遞等。80年代，首個Cav通道的基因被克隆，序列分析顯示，它與Nav通道的序列高度相似。

電壓門控離子通道的功能異常或紊亂與一系列疾病相關，比如Nav1.7直接與痛覺相關，其異常激活或失活會導致異常疼痛或者無法感知痛覺，已知Nav1.7突變會導致紅斑性肢痛症；Nav1.4或Cav1.1突變會導致低鉀性周期癱瘓；Nav1.1或Cav2.1突變導致變異型家族偏癱型偏頭痛；Nav、Cav以及Kv功能異常則可能導致心率紊亂、癲癇等。電壓門控離子通道目前是僅次於G蛋白偶聯受體（GPCR）的第二大藥物靶點。外科手術用到的麻醉劑通過抑制Nav通道起作用；Cav通道則是降壓藥物的靶點。因此，對於電壓門控離子通道的研究尤其是結構生物學研究具有重要的生理學和藥理學意義。

與Kv通道近20年的結構生物學進展相比，Nav和Cav通道的結構姍姍來遲，主要是因為與由同源四聚體構成的Kv通道不同，真核生物Nav和Cav通道由一條具有1500-2000個氨基酸的肽鏈摺疊成四個類似但不盡相同的結構域，每個結構域具有六次跨膜螺旋，相鄰結構域之間由長度各異的序列連接。這一特點使得蛋白的重組表達和結晶難度相比Kv通道都大大增加。因此，一直以來僅有納米解析度的真核生物Nav和Cav通道冷凍電鏡影像報道，無法揭示任何結構細節信息。近幾年，隨著冷凍電鏡技術的革新，利用該技術獲得近原子解析度結構已經成為現實。顏寧研究組利用清華大學的冷凍電鏡平台，首次揭示了真核生物Cav通道的結構。

Cav1.1是哺乳動物中10個電壓門控鈣離子通道中的第一個被鑒定的，主要分布在在骨骼肌，它的主要功能是在肌肉細胞接受運動神經元信號產生動作電位時感受膜電勢的變化，進而激活與其直接作用的下游肌質網膜上的高通量鈣離子通道RyR1，促使鈣離子快速大量釋放到細胞質中，從而引起肌肉的收縮，該過程稱為興奮-收縮偶聯（excitation-contraction coupling，EC coupling），Cav1.1和RyR1是引發這個過程最為關鍵的兩個膜蛋白。 2015年1月，顏寧研究組在《自然》報道了RyR1的3.8埃冷凍電鏡結構；同年12月，她們在《科學》上報道了Cav1.1的4.2埃電鏡結構。但是由於分別率所限，儘管該結構首次揭示了Cav1.1複合物中各個輔助亞基（包括α2σ亞基、β亞基和γ亞基）與離子通道亞基（α1亞基）的相互作用區域，以及離子通道亞基內部同源結構域的排布，但是大部分區域無法精確到氨基酸側鏈，因而不能對蛋白的狀態進行深入的分析。在冷凍電鏡結構中，4埃的解析度往往是一個分水嶺。要想清晰地分辨出蛋白質氨基酸的側鏈，往往需要高於4埃的解析度（數字越小解析度越高），而其難度也相應增加。

在剛剛發表的《自然》論文中，顏寧研究組通過多次嘗試，成功優化了蛋白的制樣方法，從而獲得了高質量的冷凍電鏡成像。他們從近萬張冷凍電鏡照片中挑出超過一百萬的蛋白單顆粒，利用單顆粒三維重構的方法最終獲得了整體3.6埃的近原子解析度結構，其中中心區域解析度超過3.5埃（圖1）。

圖1：Cav1.1冷凍電鏡數據

新報道的3.6埃電鏡結構相比之前4.2埃儘管在數字上看似進步不大，卻有著質的飛越。在該結構中，大部分氨基酸的側鏈能夠被清晰分辨，從而可以據此搭建出準確和完整的結構模型。新的結構揭示了大量新信息，更新了我們對電壓門控鈣離子通道的認識，比較具有代表性的特徵包括：1）該結構展示了一個處於封閉構象的鈣離子通道，而四個電壓感受器（VSD）都處於去極化狀態，因而判斷該結構展示的是一個「去活化」的狀態；2）輔助性亞基α2σ的結構被基本完整構建，其與離子通道亞基α1的相互作用也完全呈現；3）輔助性亞基α2σ是一次跨膜的蛋白還是膜錨定蛋白在之前一直存有爭議，通過新的結構並結合質譜分析，可以判斷出α2σ亞基為膜錨定蛋白；4）該結構解析了更為清晰的離子選擇性過濾器，在離子選擇性過濾器中甚至還可以看到兩團相連的密度，很有可能是結合的鈣離子；5）通過三維分類，可以得到兩個構象不同的結構。對比兩個結構可以發現胞內側的β亞基發生很大的構象變化，該構象變化可能是引起肌肉興奮-收縮偶聯的結構基礎。

圖2：Cav1.1整體三維結構示意圖

至此，顏寧研究組已經成功解析了肌肉興奮-收縮偶聯通路上的兩個關鍵膜蛋白Cav1.1以及RyR1的結構，從而為理解這一基本生理過程的分子機理打下重要的結構基礎。更重要的是，高分辨的Cav1.1結構不僅揭示了Cav通道的結構，也為理解目前仍未有高解析度結構的真核Nav通道的結構與機理提供了重要的模板，可以利用現有Cav1.1的結構嘗試解釋此前半個多世紀積累起來的有關Cav和Nav通道的大量生物實驗和臨床數據，並且為利用結構進行新型藥物設計、篩選和優化提供了重要基礎。

生命學院CLS項目五年級博士生吳建平、結構生物學高精尖中心卓越學者閆湞以及生命學院CLS項目二年級博士生李張強為本文共同第一作者；生命學院二年級博士生錢興洋在輪轉期間參與該課題實驗；醫學院周強副教授為數據處理提供了建議和幫助。北京生命科學研究所董夢秋研究員和盧珊參與質譜鑒定的合作。電鏡數據採集於清華大學冷凍電鏡平台，計算工作得到清華大學高性能計算平台、國家蛋白質設施實驗技術中心(北京)、聯想高性能計算、以及榮之聯董事長王東輝先生的支持。顏寧為本文通訊作者。本工作獲得科技部重大科學研究計劃專項和基金委創新群體支持。

1. http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature19321.html

相關論文連接：

2. http://www.sciencemag.org/content/350/6267/aad2395.full

3. http://www.nature.com/nature/journal/v517/n7532/full/nature14063.html

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