顏寧等在《科學》發文揭示心肌鈣離子通道RyR2長程門控機制的結構基礎

北京時間2016年9月22日，清華大學醫學院顏寧研究組與加拿大卡爾加里大學（University of Calgary）陳穗榮研究組合作在《科學》（Science）期刊在線發表標題為 「Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2」（2型Ryanodine受體RyR2門控機制的結構基礎）的研究長文，揭示了目前已知分子量最大的離子通道Ryanodine受體RyR2亞型處於關閉和開放兩種狀態的三維電鏡結構，探討了RyR2的門控機制。

RyR是廣泛存在於肌肉細胞（包括骨骼肌和心肌）及腦組織中的鈣離子釋放通道，其功能是在收到上游信號後，將內質網或肌質網中的鈣離子迅速釋放到細胞質中，從而觸發進一步的信號傳遞，比如導致肌肉收縮等等。在哺乳動物中，RyR有三個亞型，其中RyR1和RyR2分別在骨骼肌和心肌的興奮-收縮偶聯中發揮作用。所謂興奮-收縮偶聯（excitation-contraction coupling, ECC）是指上游的電壓門控鈣離子通道Cav在收到動作電位刺激活化後激活RyR，從而最終導致肌肉收縮這一生理過程。肌肉收縮的生理重要性不言而喻，因此從分子乃至原子水平理解興奮-收縮偶聯具有重大意義。

RyR1與Cav1.1主要在骨骼肌中發揮作用，而心臟中對應的RyR2和Cav1.2儘管序列於骨骼肌同源蛋白相近，但它們的激活方式卻存在很大差異。Cav1.1能夠與RyR1形成超級複合物，並通過構象變化激活RyR1；而RyR2的激活則主要依靠經Cav1.2湧入的鈣離子來實現。此外，RyR2的突變會導致心臟功能紊亂，引發包括兒茶酚胺敏感性多形性室性心動過速、特發性心室顫動、心臟性猝死等在內的疾病。因此，對於心臟中興奮-收縮偶聯過程的研究將有助於人們充分認識其工作機制，並為相關疾病的發生機理提供理論解釋，同時也能夠為相關的藥物開發提供指導。

在最新的《科學》論文中，顏寧研究組報道了RyR2處於關閉和開放兩種不同狀態的近原子解析度冷凍電鏡結構。RyR2蛋白樣品純化自豬心，樣品的獲取非常不易。不過得益於近年來清華大學冷凍電鏡平台的迅猛發展，最終僅利用少量蛋白樣品即解析了兩個狀態下的結構。此前數十年的研究已經積累了大量有關RyR功能調節的數據，很多蛋白、離子及其他小分子都可以結合并影響RyR的功能及通道開關，以細胞質中的鈣離子為例：濃度處於微摩（μM）量級的鈣離子會激活RyR，而當濃度達到毫摩（mM）量級後鈣離子又會反過來抑制RyR。在此次相關研究工作中，她們使用EDTA來鎖定RyR2的關閉構象，利用20 μM的鈣離子和小分子PCB 95來穩定住開放構象，從而最終獲得了解析度分別為4.2埃的關閉構象和4.1埃的開放構象的兩個結構。

通過比較關閉和開放狀態的兩個結構（如圖所示），她們發現位於穿膜區域負責通透離子的通道有明顯的變化：在開放構象中，該通道發生擴張，從而使得鈣離子能夠順利地從肌質網內部轉移到細胞質中。RyR細胞質一側的可溶區域佔據整個蛋白很大的比例，在開放狀態下，這部分區域向著肌質網膜靠近，同時還伴隨著一定程度的旋轉。通過對RyR2中每個相對獨立的結構域的仔細比較和分析，她們認為中心結構域（Central domain）極有可能是引發RyR開放的關鍵，這一發現與之前有關RyR的功能研究結論相吻合。另外，在這篇研究文章中，她們還對部分觀察到的結構信息進行了功能方面的驗證研究，從而更加全面地展示了RyR2的結構及功能特性。

特別值得一提的是，這項研究成果是顏寧研究組在離子通道，特別是興奮-收縮偶聯領域取得的又一重要進展。在此之前，顏寧研究組發表了一系列工作，包括第一個RyR1的高解析度原子結構以及第一個Cav1.1複合物的高解析度冷凍電鏡結構。她們的後續研究進一步表明，即使在通道保持關閉時，RyR1的胞質區也依然會呈現出不同的動態變化。另外，她們還獲得了解析度為5.7埃的RyR1開放構象結構，並基於結構比對，初步分析了RyR1的門控機理。有關RyR1的這些成果已作為兩篇研究論文分別發表在《自然》（Nature）和《細胞研究》（Cell Research）雜誌，有關Cav1.1的兩篇論文分別發表於《科學》和《自然》雜誌。上述研究與最新的這篇《科學》論文極大地促進了我們對於興奮-收縮偶聯的理解。

關閉及開放構象的RyR2

這篇研究論文的通訊作者是清華大學醫學院的顏寧教授和卡爾加里大學的陳穗榮（S. R. Wayne Chen）教授，共同第一作者為清華大學生命學院2011級PTN項目彭偉博士、2012級PTN項目博士生申懷宗、以及2012級CLS項目博士生吳建平。國家蛋白質科學研究（北京）設施清華大學冷凍電鏡平台為數據收集提供了支持，清華大學高性能計算平台為數據處理提供了支持。相關研究得到了科技部、國家自然科學基金委、以及加拿大相關研究機構的經費支持。顏寧教授是生命中心PI，清華大學醫學院教授、拜耳講席教授及霍華德休斯醫學研究院國際青年科學家。

來源：生命科學聯合中心

http://science.sciencemag.org/content/early/2016/09/23/science.aah5324

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