掃盲貼：如何評估NGS文庫的質量？

NGS文庫製備的目標是在DNA或cDNA片段上連接廠家特異的接頭，讓它們能夠在NGS平台上測序。這個概念似乎非常簡單，不過實現這個目標可比你想像的要複雜得多，而只有嚴格的質量控制才能確保最佳的結果。

專家認為，成功測序的兩個決定因素是文庫材料的質量和數量。評估片段的大小分布以及文庫的準確濃度是兩個關鍵的參數，可幫助你評估文庫的質量。除了這兩個標準的質量指標，下面還有一個重要指標，可幫助你判斷文庫製備的整體質量。

1、轉化率

轉化率指的是有多少起始分子被轉化成「可測序的」片段，或者兩端加上接頭的片段。一種簡單的計算方法是將測得的文庫產量除以理論的最高產量。在計算過程中，PCR的擴增效率和純化過程中的損失必須考慮進去。此外，我們還要考慮到，qPCR文庫定量方法不能區分特異文庫和接頭二聚體，不適合接頭二聚體濃度高的片段。對於這種文庫，建議使用電泳方法來定量。

例如，假設PCR擴增效率為95%，而純化過程損失20%的樣品，那麼理論上的最高產量如下：

轉化率的定義為測得產量與理論最高產量之間的比值。它在很大程度上受到連接效率的影響。因此，對於好的文庫製備試劑，它的酶和緩衝液配方必須經過優化，以確保連接效率最高。

2、複雜度

在文庫製備過程中，若轉化率高，偏向性少，則能從樣品中捕獲更多獨特的分子。更多獨特分子被測序，這意味著數據集中的重複讀取更少。重複讀取不能帶來有意義的信息，可能導致變異頻率改變。因此，在數據分析時需要去除重複讀取。

庫的複雜程度就越低。因此，對於低於納克級的樣品，高的連接效率和轉化率是尤為重要的，這才能儘可能地捕獲有限樣品中的最大複雜度。

3、均一性

覆蓋均一性指的是讀取在基因組或目標區域內的分布均一程度。覆蓋越均勻，達到特定深度所需的測序就越少。覆蓋均一性的偏向通常是在文庫製備和文庫擴增步驟中引入的。在很多時候，覆蓋均一性表現出明顯的GC偏向，也就是說，覆蓋更少或更多，這取決於GC含量。

4、準確性

NGS文庫製備的準確性越高，你對變異報告的信任程度就越高。核苷酸錯誤通常在PCR擴增以及測序過程中引入。測序錯誤通常低於1%。通過使用高保真PCR試劑，可盡量減少文庫擴增的錯誤。NGS對照樣品也有助於評估NGS流程的準確性。

在文庫製備過程中，這些關鍵的質量指標都必須考慮，才能獲得更好的結果。

本文來源：生物通

本期編輯：cheery、fenger

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