脂肪來源幹細胞療法（上）

脂肪來源幹細胞療法：臨床前研究到臨床應用的轉化

自體脂肪組織為組織工程和再生醫學的研究及應用提供了豐富的基質/幹細胞來源。研究者現已通過酶消化的方法，從腹壁整形術或吸脂術廢棄的脂肪組織中分離提取基質血管成分細胞（stromal vascular fraction cells, SVF）。SVF是一種脂肪來源幹細胞（adiposederived stemcells, ADSCs）與其他細胞成分相混雜的群體，經過體外貼壁培養後可獲得較純的ADSCs。近十年來，大量的基礎研究證實，無論是新鮮分離的異質性的SVF，還是培養擴增後相對同質性的ADSCs，都具有自我更新與多向分化潛能。此外，越來越多的動物實驗研究證實，SVF和ADSCs可治療多種疾病，如缺血性疾病、骨組織病、神經系統疾病和自身免疫性疾病等。這些研究結果為ADSCs治療步入臨床試驗階段提供了大量的證據支持。目前，已有來自全世界的66個臨床試驗研究以「脂肪幹細胞」為題名，在美國國立衛生研究院（NIH）的官方網站（Clinical Trials.gov）上進行了註冊。這些臨床試驗涉及ADSCs治療的有效性、不良反應及安全性等問題，其中一部分研究結果已以學術論文的形式發表出來。

這些前瞻性的臨床試驗研究及其初步結果無疑是令人鼓舞的。但ADSCs作為一種新型的細胞製品，其作用機制及應用於體內的生物安全性、穩定性等問題仍不十分清楚。筆者主要回顧了目前已報道的自體ADSCs在整形外科相關疾病治療中的研究及應用現狀，探討了以SVF和ADSCs為基礎的細胞治療向臨床應用轉化過程中所面臨的挑戰。

ADSCs的臨床前研究及相關問題

ADSCs的鑒定

ADSCs是一種中胚層來源的間充質幹細胞，最早由Zuk等從人脂肪組織抽吸物中分離培養出來，並證實其具有多系分化潛能和橫向跨胚層分化能力，在恰當的誘導條件下能向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、肌肉細胞、神經細胞及心肌細胞等定向分化。但由於目前還沒有一個單一的分子能夠作為ADSCs的特異性免疫表型，因此對其鑒定方法尚無統一的標準。

國際細胞治療協會間充質和組織幹細胞分會（Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the InternationalSociety for Cellular Therapy）對間充質幹細胞的定義包括以下幾個要點：在標準培養環境下具備塑料黏附性；細胞表面表達CD73/CD90/CD105分子，同時不表達CD15CD34CD45、CD11b/CD79和CD19/HLADR；在體外可分化為成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞。有研究者認為，可以將這些標準用於ADSCs的純化和鑒定。然而，新鮮分離的SVF混雜有其他細胞標誌，如血管內皮細胞(CD31)、管壁細胞(CD140)、單核細胞(CD14)、巨噬細胞(CD11)、造血細胞(CD45)、紅細胞(Terl19)、淋巴細胞(CD3、CD4、CD8、CD19)等；而體外培養的ADSCs經多次傳代後，表型也會發生變化，如CD34的表達消失、CD105的表達隨傳代次數的增加逐漸上調。如何建立統一的SVF和ADSCs免疫表型鑒定標準仍是一個亟待解決的問題。

此外，國際幹細胞研究學會(International Society for Stem Cell Research, ISSCR)在2009年發布的《幹細胞臨床轉化指南》中提出，幹細胞製品在應用於人體之前還需要進行mRNA、miRNA、DNA甲基化、蛋白表達、細胞活性、細胞增殖率等方面的檢測。這些鑒定方法的建立應在保證不損傷幹細胞活性的前提下，具備實用性及可重複性，以滿足未來幹細胞製品工業化生產的需要。

ADSCs在動物實驗研究中的應用結果

ADSCs現已成為整形及修復重建外科的研究熱點，大量的動物實驗證實，SVF和ADSCs在促進移植脂肪成活、修復軟組織損傷、促進骨組織再生等治療中的有效性。Zhu等應用小鼠顱骨表面自體遊離脂肪移植模型，探討了自體SVF與遊離脂肪組織共同移植對脂肪移植物成活率的影響。移植後9個月的實驗結果顯示，應用SVF的實驗組成活的脂肪移植物重量不僅是對照組的1倍，而且移植物內的新生血管數量也比對照組明顯增加。Levi等應用於小鼠顱骨缺損模型，證實了ADSCs能夠刺激小鼠自體骨組織的修復。他們將人ADSCs與具有成骨誘導功能的細胞支架複合後，植入免疫缺陷小鼠的顱骨缺損部位，結果實驗組的顱骨癒合情況明顯優於未經ADSCs治療的對照組。雖然ADSCs是如何刺激自體骨組織修復的機制並不十分清楚，但研究發現，缺損部位骨性標誌物和成骨基因的表達明顯增加。此外，體外實驗發現，Hedgehog（Hh）信號通路參與了ADSCs的成骨細胞分化，提示人ADSCs有可能通過Hh信號的刺激作用促進了骨組織的修復。除了上述提到的SVF和ADSCs在促進移植脂肪成活、修復骨組織缺損中所發揮的作用，新近發現SVF和ADSCs還可以用於皮膚燒傷、放射性損傷及創面癒合等方面的治療。Ebrahimian等分別應用小鼠皮膚非放射性損傷及放射性損傷模型，進行了ADSCs局部注射促進創面癒合的研究。結果顯示，無論在生理性或病理性的條件下，ADSCs都能有效促進創面的再上皮化，同時還能刺激局部的毛細血管再生，這為創面癒合的治療提供了新思路。

SVF和ADSCs的動物實驗結果為ADSCs治療進入臨床研究階段提供了直接的證據。然而，由於動物與人存在天然的種屬差異，幹細胞移植於人體後有可能出現的生物學效應、毒性反應，並不能在動物實驗中完全的反應出來。大多數應用SVF及ADSCs的動物實驗研究都集中於嚙齒類動物模型。其中，免疫缺陷類嚙齒動物模型在檢驗人細胞移植的效果、體內植入物情況、分化細胞的穩定性以及癌症風險等方面尤其有價值。然而大動物模型在評估有效的細胞劑量、移植後的細胞成活、細胞反應、細胞遷移以及長期細胞植入物的免疫障礙等方面更為重要。雖然目前也有少數研究應用大動物模型來評估SVF和ADSCs的治療效果，但由於犬、豬、羊、兔等大動物缺少相應的抗體試劑來進行細胞示蹤及免疫表型鑒定，使研究方法的選擇受到極大限制。此外，關於SVF和ADSCs植入體內後的毒副作用，目前還很少有研究報道。體外培養的ADSCs，尤其是在長期以及壓力環境下，可能會變為非整倍體或發生DNA重組，從而帶來嚴重的病理改變，向腫瘤細胞轉化。新鮮分離的SVF因混雜有其他不同類型的細胞成分，也必須要通過進一步的動物實驗明確其有無非正常的分化。

ADSCs在促進組織損傷修復中的作用

目前認為，ADSCs在促進組織損傷修復過程中可能發揮以下作用：促血管化作用。大量的研究證明，ADSCs在缺氧、缺血及損傷等條件下，可釋放多種促血管化的細胞因子，如肝細胞生長因子和胰島素樣生長因子等，並參與了組織損傷修復的血管化過程。旁分泌作用。ADSCs還可以通過旁分泌機制，誘導其周圍的成纖維細胞分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白，促進皮膚表皮細胞的成熟，以利於創面癒合和瘢痕縮小。分化作用。越來越多的證據表明，當成體幹細胞被移植入受區後，會表現出很強的可塑性，例如ADSCs在缺血缺氧的環境下可被直接誘導分化為血管內皮細胞參與局部組織的再血管化，這種現象被稱為幹細胞的橫向分化。

關於幹細胞橫向分化的調控機制目前還不清楚，大多數觀點認為，幹細胞的分化與微環境密切相關。可能的機制是，幹細胞進入新的微環境後，對分化信號的反應受到周圍正在進行分化的細胞的影響。然而微環境究竟為幹細胞提供了哪些分子信號，這些分子信號在調節幹細胞自我更新和分化中起了什麼作用，仍是臨床前研究關注的重點。

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