有了「基因魔剪」的育種新方案，種質的多樣性有救了

圖1，番茄品種有著大量的遺傳多樣性（圖片來自www.fromfilmerstofarmers.com）

撰文 | 汪鴻儒（遺傳學博士）

責編 | 陳曉雪

知識分子為更好的智趣生活ID：The-Intellectual

對於CRISPR-Cas9基因編輯技術，人們一直有著兩個最為重要的期待：在生命健康領域，幫助治療疾病；在農業領域，用於育種。最近，美國冷泉港一實驗室主導的一項研究（Rodriguez-Lealet al., 2017），為基於基因編輯的分子育種提供了一個令人振奮的解決方案。在這篇發表在《細胞》的文章中，研究人員通過對影響番茄果實大小、花序結構和生長習性三個性狀的順式調節元件的編輯，實現了對這些複雜數量性狀的精細操控。並通過簡單的遺傳設計，在受體品種中迅速固定目標性狀。這一研究不僅大大擴展了育種上可用的自然變異，也為解析基因調控變化和數量性狀間複雜關係奠定了基礎。鑒於新的方案很容易地在其他作物甚至動物中推廣開來，在可預見的未來，一場農業育種和數量遺傳學研究的革命即將爆發。

番茄好吃又高產，可不容易

提高番茄的產量，有兩個方向：讓單個番茄長得更大，或者讓一株番茄上掛更多果實。對於這兩個特徵，科學術語為性狀，簡單稱之為果實大小和果實數目的性狀。在自然界中，番茄存在著大量的遺傳多樣性，僅在世界蔬菜中心的資源庫中，就收藏了7000多份不同的野生和栽培番茄品種（圖1）。當然，我們關心的果實大小和果實數目兩個性狀，也會呈現出多樣性（圖2和圖3）。育種學家們首先會對種質資源庫進行篩選和鑒定，例如，尋找一個果實大的番茄品種，通過雜交，將果實大的性狀引入到好吃的番茄品種，再通過選育，最終獲得又好吃又大的番茄。

圖2. 不同番茄品種在掛果數量性狀上表現出很大的遺傳變異 （Park et al. 2014）

遺憾的是，只有在最理想的狀況下，上面的技術路線才會按照預期實現目標。大多情況下，總會有一些我們不喜歡的性狀與果實大小性狀相伴，如番茄變大了，但味道也變差了，或者新的番茄品種更容易生病了。育種學家想對原有好吃的番茄品種進行一次「乾淨的系統升級」，並非想像的那麼簡單！

性狀調控的分子網路和「調節器」

遺傳學研究發現，性狀是由基因控制的。過去一百多年，分子遺傳學家們一直試圖弄清楚類似番茄果實大小這種性狀是由哪些基因控制的，這些基因之間又是如何相互作用並影響到番茄風味的。弄清了這些，科學家們就可以從基因層面，把隻影響果實大小的部分摘出來放到受體品種中，在品種改良時就可以實現「乾淨的升級」了！

經過不同領域分子遺傳學家們的辛勤工作，生物性狀分子基礎及組織形式的神秘面紗已經揭開。人們發現，每個性狀實際上都是由一個複雜的分子網路在調控，而網路上的每一個節點就是一個基因。番茄果實大小性狀也不例外，它由一個複雜到令人頭疼的分子網路調控著，風味性狀也一樣。糟糕的是，這兩個網路是交織在一起的，並又聯到控制其他性狀的網路上，從而形成一個更大更複雜的網路。這是一個壞消息，因為如果破壞了果實大小分子網路上的一個基因，可能就會波及到調控果實風味的網路，影響口味。正所謂牽一髮而動全身！但好消息是，科學家發現在這個巨大網路上，幾乎每個節點基因上都設有各種「調節器」。有一類「調節器」，叫做順式調節元件（cis-regulatory element），它們對網路節點實行著精細而又準確的微調。它們控制著基因表達量的大小和基因的剪接形式；也可以接收另一類關鍵調控子——轉錄因子（或者稱作反式調節元件，trans-regulatory element）下達的指令，讓基因在特定的時間、特定的組織並以特定的量表達。一個「調節器」，往往可以對應一個特異的表型，因而實現對性狀的模塊化管理。也就是說，順式調節元件像一個個功能專一的零件，當你改變順式調節元件的時候，可以實現只對一個性狀的特異性的調節，而這個正是我們想要的！

分子育種家們非常青睞這些「調節器」，在不同品種番茄的基因組中，這些「調節器」的版本不同，會造成信號的強弱不同，最終映射到性狀上，表現出來性狀的多樣性。以番茄的大小為例，它的一個調節器位於一個名叫fasciated基因的內含子上。在兩個不同的番茄品種中，這一「調節器」的差異，就導致了fasciated基因表達量的不同，最終造成番茄果實大小的差異（圖3）（Conget al., 2008）。對於好吃的番茄，我們對它基因組上的「調節器」做一下調換，就可以育出又好吃又大的番茄品種啦！

圖3. 不同番茄品種在果實大小性狀上表現出的多樣性，fasciated基因內含子區域的序列變異貢獻了這一性狀的差異（Conget al. 2008）

不過，目前的這套分子育種系統也有它的不足。第一，它依賴於自然界現有的調節元件的變異。在fasciated基因的例子中，我們幸運地在自然界發現了某一個版本的調節元件，正好可以「調製」出大個的番茄，如果自然界沒有這一版本的調節元件呢？第二，要實現對基因組上一個零件的調換，一般採用的是雜交的方式，需要很多代，因此這個育種系統非常耗時。而冷泉港科學家採用CRISPR-Cas9「基因魔剪」技術，巧妙地破解了這兩個難題，從而釋放了這一育種系統的無窮潛力。

快速產生變異的一體化操作

冷泉港Lippman實驗室的科學家首先瞄準lc和fasciated兩個基因，它們分別控制著果實形狀和大小這兩個數量性狀。針對它們的順式調節元件區域，設計多個靶點，進行了定點編輯，產生了不同的DNA序列變異，也造成了不同的表型效果。為了在後代中獲得更加多的新變異，研究者採用了一個非常聰明的設計：他們將第一步獲得的嚴重功能缺失的番茄植株和正常的番茄雜交。如此，在它們的後代群體中，一方面它們攜帶了CRISPR/Cas9的轉基因，另一方面攜帶了目標基因的雜合形式。通過後代的分離，就會快速產生大量的、一系列目標基因突變的植株，對應到表型，會有著連續型的變異，其中有一些變異是很微小的。在fasciated基因的例子中，他們鑒定了1000多個雜交後代，其中將近一半攜帶了CRISPR/Cas9的轉基因，而攜帶轉基因的植株中又有一半產生了表型的差異。通過PCR鑒定發現，這些植株的基因組在目標區域確有新DNA變異產生。最後，通過對這些含有變異的番茄進行自交，可以很快地固定新變異，並且去除CRISPR/Cas9轉基因。另外一個基因控制開花時間和生長習性的基因SP，它在自然界的現有變異形式較少。研究者也採用類似的思路，對其順式調節元件區域進行編輯，「生產」了一系列株型的變異，而其中不乏應用上優異的變異（圖4），為育種創造了豐富的可用「零件」。

圖4. SP基因啟動子區不同的等位變異產生一系列的植物株型的多樣性（Rodriguez-Leal et al. 2017）

這一育種方案重要特點是，直接對受體品種中的目標基因（如控制番茄大小的基因）進行編輯，可以快速大量產生一系列變異，然後從後代中鑒定篩選出理想的株系。這是一套產生新變異、在目標品種中整合新變異的一體化操作，避免了從其他株系導入基因的耗時步驟，大大縮短了育種周期。

種質多樣性有救了

「發掘自然界新變異，整合有利變異」是長達近萬年作物馴化的主題，也是現代育種研究的主要思路，但它依賴於本物種現有的遺傳多樣性。而遺傳多樣性的基礎——豐富的自然變異，是靠本物種的群體在長達數萬甚至數百萬年的時間裡產生，並歷經一系列群體事件，而最終保留至今。隨著全球人口增長，人的生存空間和生態環境之間的衝突加劇，這些物種種群遭到破壞，多樣性也會不斷丟失。科學家們在全球建立了許多重要作物的種質資源庫，大大延緩了全球物種多樣性的丟失。但是，放在種子庫中的種子，又失去了隨著環境變化不斷產生新變異的機會。

Lippman實驗室的育種設計規避了這些問題，大大突破了「物種現有自然變異」的限制；另一方面，也避免了在自然變異的汪洋大海中尋找優異變異的操作，而是針對特異的基因組靶點，自行創造育種所需新變異。

突破「物種現有自然變異」限制，除了育種上的巨大價值，也為數量遺傳學研究帶來了前所未有的契機。自然界中現有基因變異，往往都是自然選擇的結果，不適應環境的變異已經被剔除。實際上，那些「不適應」的變異，對於數量遺傳學研究卻是寶貴的材料。Lippman實驗室的這一研究通過在順式轉錄元件位置創造大量突變，從而製造出調控效果不同的等位變異，進而對數量性狀的分子網路產生不同的調控作用，產生不同的表型。通過大量創造DNA變異以及對應不同表型這一對「輸入」和「輸出」，研究者可以系統評估順式調節元件的功能，研究它們參與的分子模塊以及時空組織形式。無疑，Lippman實驗室的這一項開創性的工作，將幫助植物學家再次引領數量遺傳學的研究。

參考文獻：

Cong, B., Barrero, L.S., and Tanksley, S.D. (2008). Regulatory change inYABBY-like transcription factor led to evolution of extreme fruit size during tomato domestication. Nat Genet 40, 800-804.

Park, S.J., Jiang, K., Tal, L., Yichie, Y., Gar, O., Zamir, D., Eshed,Y., and Lippman, Z.B. (2014). Optimization of crop productivity in tomato using induced mutations in the florigen pathway. Nat Genet 46, 1337-1342.

Rodriguez-Leal, D., Lemmon, Z.H., Man, J., Bartlett, M.E., and Lippman,Z.B. (2017). Engineering Quantitative Trait Variation for Crop Improvement by Genome Editing. Cell 171, 470-480 e478.

製版編輯： 斯嘉麗｜

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