三位科學家因發展冷凍電子顯微鏡技術獲諾貝爾化學獎

北京時間10月4日17時45分許，2017年諾貝爾化學獎頒給雅克·杜波切特(Jacques Dubochet), 阿希姆·弗蘭克(Joachim Frank)和理查德·亨德森(Richard Henderson)，表彰他們發展了冷凍電子顯微鏡技術，以很高的解析度確定了溶液里的生物分子的結構。

圖片來源：諾貝爾官網。

獲獎人簡介

約阿基姆·弗蘭克（Joachim Frank）德裔生物物理學家，現為哥倫比亞大學教授。他因發明單粒子冷凍電鏡（cryo-electron microscopy）而聞名，此外他對細菌和真核生物的核糖體結構和功能研究做出重要貢獻。弗蘭克 2006 年入選為美國藝術與科學、美國國家科學院兩院院士。2014 年獲得本傑明·富蘭克林生命科學獎。

理查德·亨德森（Richard Henderson）蘇格蘭分子生物學家和生物物理學家，他是電子顯微鏡領域的開創者之一。1975 年，他與 Nigel Unwin 通過電子顯微鏡研究膜蛋白、細菌視紫紅質，並由此揭示出膜蛋白具有良好的機構，可以發生α- 螺旋。近年來，亨德森將注意力集中在單粒子電子顯微鏡上，即用冷凍電鏡確定蛋白質的原子解析度模型。

雅克·迪波什（Jacques Dubochet）， 1942 年生於瑞士，1973 年博士畢業於日內瓦大學和瑞士巴塞爾大學，瑞士洛桑大學生物物理學榮譽教授。Dubochet 博士領導的小組開發出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術製作不形成冰晶體的玻璃態冰包埋樣品，隨著冷台技術的開發，冷凍電鏡技術正式推廣開來。

革命性的冷凍電鏡技術

細胞裡面的生命活動井然有序，每一個部分都有其特定的結構，承擔不同的功能。生物大分子則是一切生命活動的最終執行者，它們主要是核酸和蛋白。核酸攜帶了生命體的遺傳信息，而蛋白是生命活動的主要執行者。自現代分子生物學誕生以來的半個世紀里，解析和分析生物大分子的結構、進而闡釋其功能機制一直都是現代生命科學的核心問題之一。

事實上，一切自然科學都涉及物質結構及結構間的相互作用為核心的研究方向，天文學研究宇宙、星體等的結構及其相互作用，粒子物理研究物質世界的基本粒子的結構和相互作用，甚至包括應用性很強的材料科學都是以研究新型材料的結構和性質等為核心。結構生物學研究的直接目的是弄清楚生命大分子結構，從而更好地理解生命，理解這個自然界中「逆熱力學第二定律」而誕生的奇蹟；最終目標是公眾通常關心的實用價值。

像數學物理公式不會直接造出飛機、導彈、計算機一樣，蛋白質結構這樣的基礎研究不會直接轉化為人們生產生活的必須物品。比較具體的應用，如藥物設計、疫苗開發、醫療診斷和蛋白質分子性能改造（如科學實驗或工業生產中酶活性穩定性優化）等是蛋白質結構研究比較容易被大眾所理解的一個方向，但卻只是其研究價值的一個側面而已。

蛋白質結構如同生命科學裡的數學公式和物理定律，甚至在以後會充當生命科學裡面的「化學元素周期表」，除了幫助發現或設計新葯等，它更重要的價值是作為最基礎最上游的研究之一，通過影響一切與其密切相關的下游科學和技術，從而改變我們的世界。

結構生物學最早誕生於上個世紀中葉，它是一門通過研究生物大分子的結構與運動來闡明生命現象的學科，在其發展史上有兩個里程碑式的事件，一個是DNA雙螺旋結構的發現，另一個肌紅蛋白（Myglobin）晶體結構的解析，這兩個事件都是上個世紀最重要的革命性科學進展，均在劍橋MRC分子生物學實驗室完成，並且都於1962年獲得了諾貝爾獎（一個生理學或醫學獎，一個化學獎）。同時它們都是最早使用X射線的方法來解析生物大分子結構，而這個方法在過去半個世紀里，一直佔據結構生物學的統治地位。

在當今結構生物學研究中普遍使用的冷凍電鏡，是上個世紀七八十年代開始出現、近兩年飛速發展的革命性技術，它可以快速、簡易、高效、高解析度解析高度複雜的超大生物分子結構（主要是蛋白質和核酸），在很大程度上取代並且大大超越了傳統的X射線晶體學方法。

冷凍電鏡並不是這兩年才建立的。在蛋白質X射線晶體學誕生大約10多年以後的1968年， 作為里程碑式的電鏡三維重構方法，同樣在劍橋MRC分子生物學實驗室誕生，Aron Klug教授因此獲得了1982年的諾貝爾化學獎。另一些突破性的技術在上世紀70年代和80年代中葉誕生，主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術。這裡面的代表科學家有Ken Taylor, Robert Glaeser和Jacques Dubochet等。

快速冷凍可以使蛋白質和所在的水溶液環境迅速從溶液態轉變為玻璃態，玻璃態能使蛋白質結構保持其天然結構狀態，如果以緩慢溫和的方式冷凍，這個過程會形成晶體冰，生物分子的結構將被晶格力徹底損壞。低劑量冷凍成像能夠保存樣品的高解析度結構信息，確保了從電鏡圖形中解析蛋白質結構的可能性。與此同時Joachim Frank等則在電鏡圖像處理演算法方面奠定和發展了這項技術的理論基礎。由此冷凍電鏡的雛形基本建立，總的思路為：

1）樣品冷凍（保持蛋白溶液態結構）；

2）冷凍成像（獲取二維投影圖像）；

3）三維重構（從二維圖像通過計算得到三維密度圖）。

該方法為生物大分子結構研究提供了一個和X射線晶體學完全不一樣的、全新的思路。但是由於技術方法的瓶頸，在此後30多年的時間裡只能做一些相對低解析度的結構解析工作，在解析度上一直不能和X射線晶體學比較，甚至一度被嘲笑為」blob-ology「（英文諷刺語，「一坨輪廓的技術」）。

但對於冷凍電鏡來說，技術難點遠非單純冷凍。冷凍成像和圖像處理演算法一直都是瓶頸。從冷凍電鏡技術誕生以來的近30年時間裡，其一直都有進展，只是相對比較緩慢。

最重要的革命性事件大約發生在兩三年前：一個是直接電子探測器的發明，另一個是高解析度圖像處理演算法的改進。MRC分子生物學實驗室的兩位科學家Richard Henderson和Sjors Scheres在這次革命中起了關鍵作用（作者註：現代科技革命往往是諸多研究機構若干團隊共同參與，此處僅列舉關鍵代表，並且僅從技術角度討論，不涉及生物學應用）。

Richard Henderson是探測器方面的先驅，而Sjors Scheres則因他設計的Relion程序而名聲大噪，他們由此當選為《自然》雜誌2014年「十大科學進展年度人物」。兩位科學家一個從硬體，一個從軟體將冷凍電鏡技術推向了巔峰，將冷凍電鏡技術的解析度推向了新高度。（作者注: Henderson教授的貢獻遠非探測器一個方面，包括冷凍電鏡理論基礎、演算法、軟體，重要生物大分子應用，如曾首次解析視紫紅質跨膜螺旋等等方面；早在20多年前，他就通過一系列理論分析，預言了冷凍電鏡研究的尺度、解析度極限、技術瓶頸等等，並且斷言：冷凍電鏡將超越其它一切技術方法，成為蛋白質結構研究的主導工具，如今這些預言全部應驗。）

和此前使用的CCD相比，新發展的直接電子探測器不僅在電鏡圖形質量上有了質的飛躍，同時在速度上大幅提高，還可以以電影的形式快速記錄電鏡圖像。這些特性同時也伴隨著電鏡圖像處理方面的重大變革，電鏡技術此前在解析度上的一個主要瓶頸是電子束擊打生物樣品造成的圖像漂移和輻射損傷。有了快速電影記錄，我們就可以追蹤圖像漂移軌跡而對圖像做運動矯正和輻射損傷矯正，大大提高數據質量。

儘管如此，電鏡圖像處理一直都是一項極具挑戰性的任務，主要的問題是冷凍電鏡的圖像噪音極高、信號極低，而我們的目標是從中提取近原子解析度的結構信息，這就像在一個機器轟鳴的工廠里監測一隻螞蟻爬行的聲音。冷凍電鏡科學家就是要完成這項艱巨的任務，並且真的做到了。有了硬體和軟體方面的雙重提高，冷凍電鏡的解析度目前已得到了極大的提高，可以和晶體學相媲美；並且在其它方面已經大大超越了晶體學。

主要體現在下面幾個方面：

第一，不需要結晶，研究對象範圍大大擴展，研究速度大大提高。對於小分子，比方說無機鹽礦物質等自發就能長出晶體，小而且穩定的蛋白質目前來說結晶並不困難，但是這類意義重大的蛋白幾乎都已經解析完了，在科學上沒有任何重大意義；當今時代，小蛋白已經完全不能滿足科學家們強烈的探索慾望，結構生物學研究的對象越來越大，體系越來越複雜，結晶幾乎成為不可能的事情，即使能結晶，也不一定衍射，有衍射也不一定能得到原子解析度結構。

很多年前，許多蛋白質晶體科學家為了完成一項艱巨的任務，一個課題少則5到10年，多則20年，核糖體從上世紀80年代初首次長出晶體到2000年左右最終拿到原子解析度結構整整經歷了20年；線粒體呼吸鏈複合物I從上世紀90年代初研究，第一次報道完整晶體結構大約是20年以後。

而冷凍電鏡方法跳過超大分子複合物結晶難的這層技術屏障，以直接解析複合物的溶液狀態的結構為目標。

現在利用這項技術，在MRC-LMB一周時間就可以解析一個新的核糖體結構；英國皇家學會主席、MRC-LMB結構中心主任Venki Ramakrishnan 教授，因為核糖體的晶體結構研究而獲得2009年諾貝爾化學獎。他的實驗室在2014年發表了最後一篇晶體結構文章，此後的文章全部以冷凍電鏡為主。哥倫比亞大學有一個非常執著的博士後，研究蘭尼鹼受體（Ryanodine Receptor）晶體結構長達十年之久，最後放棄了晶體，轉向了冷凍電鏡技術，同時與清華大學教授顏寧和LMB的Scheres研究組合作，幾個月就解決了這個難題，並且達到近原子解析度。

第二，樣品需求量小，樣品製備快，可重複性高。重要生物樣品都是非常珍貴的，總體來說是以微克或者最多以毫克來計量，即使得到這點樣品，也要花費生物學家幾周、幾個月甚至更長的時間（大多數時候都需要摸索各種條件使樣品處於相對穩定的狀態，以便做進一步結構研究）。

蛋白質晶體一般要求高濃度大體積，沒有量變就沒有質變。而同樣量的蛋白可以稀釋以後製備若干冷凍電鏡樣品，每個樣品有成百上千的區域，每個區域有幾百個小孔，每一個小孔甚至可以收集多張照片。解析一般蛋白的原子結構需要幾萬個顆粒，而對於高對稱性的樣品幾千個顆粒就足夠。

第三，可以研究天然的、動態的結構。X射線晶體學研究生物大分子結構的一個主要弱點是無法拿到天然的動態的結構，這是因為研究人員無論如何也無法繞開結晶這個過程。冷凍電鏡就是要做這件事情：直接解析天然的、溶液態的、動態的（dynamic），甚至原位(in situ)的結構，從而理解生命分子如何在空間和時間兩個尺度上以活的動態的方式發揮功能。

晶體學只能嘗試不同的條件獲得生物大分子某個或者某些固定的狀態，而且容易出現晶體堆積引起的不真實相互作用方式。形象地說，冷凍電鏡可以製作完整的高清電影，晶體學只能從電影里截屏。

第四，技術革命還將開啟巨大的潛在醫療價值。冷凍電鏡技術方法在時間和精度方面的大幅度提高有時會導致不可預測的重大科學和應用價值。比如，活體病毒結構分析如果可以在分鐘級別完成，這將有可能轉化為潛在的醫療檢測手段：從病人體內抽取血樣或感染組織細胞，幾分鐘以後，非常清晰明了地展現病人在細胞內部結構層面的異常狀況，甚至給出局部的原子結構圖，從而給出精準的治療方案。這個想法現在可能聽起來有點像笑話，或許再過若干年人們就不這樣認為了。

當然冷凍電鏡的革命性不僅僅體現在上述四方面，在此就不一一列舉。有關冷凍電鏡更加詳細的介紹，可參見筆者等2010年的中文綜述（《生物物理學報》，2010年7月，第26卷，第7期: 533-559）。文章中對未來幾年的發展趨勢所做的展望，如直接電子探測器的普及、非對稱性蛋白複合物近原子解析度結構解析、冷凍電鏡相關計算性能的大規模提升等等，目前絕大多數都在過去的兩三年內得以實現並飛速發展。

Frank 師從德國著名的電子顯微學家Hoppe博士，Hoppe學派主張對任意形狀樣品直接三維重構，後來的電子斷層三維重構及cryoEM三維重構技術都與他的早期思想有關。Frank博士提出基於各個分散的全同顆粒（蛋白）的二維投影照片，經過分類對位平均，然後三維重構獲得蛋白的三維結構，發展了一系列演算法並編寫軟體（SPIDER）實現無需結晶的蛋白質三維結構解析技術。尤其在核糖體三維重構方面有一系列的重要開創性工作，可惜當年核糖體結構諾貝爾獎沒有給他。現在給他在cryoEM單顆粒三維重構的一個諾貝爾獎，實至名歸。

來源：銳動源、中新網等

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