生命科學領域的突破性技術（一）

iNature：經過iNature編輯組整理了歷年的諾貝爾自然學獎（包括物理學獎，化學獎，生理醫學獎）及最新的科研進展，遴選出了10項改變了全球生命科學領域的技術，這10項技術分別是：X射線的發現及應用，DNA是遺傳物質,測序方法的發明及應用（包括DNA及蛋白質測序）,PCR技術的誕生,基因操作技術（包括CRIPSR及RNAi）,顯微鏡的出現及應用，色譜技術的發展及應用，分子克隆技術，重編程技術（iPS及相關），蛋白的標記技術（尤其是GFP標記）。

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X射線的發現及應用

1895年11月8日發現了X射線，為開創醫療影像技術鋪平了道路 ，與1901年獲得了首個諾貝爾物理學獎。這一發現不僅極大的推動了醫療方面，而且因為這個，Henri Becquerel 及居里夫婦發現了天然放射性現象，他們與1903年獲得了諾貝爾物理學獎。

第一張X射線圖片

來源維基百科

但是，X射線是怎麼樣同生命科學聯繫在一起的呢？這主要由三位學者做了奠基性的工作。在1912年，德國物理學獎Max von Laue發現了晶體的X射線衍射現象，這是固體物理學中具有里程碑意義的發現，從此，人們可以通過觀察衍射花紋研究晶體的微觀結構，並且對生物學、化學、材料科學的發展都起到了巨大的推動作用，因為這個，Laue在1914年獲得了諾貝爾物理學獎。

Max von Laue

來源諾貝爾官網

雖然Laue發現了X射線衍射現象，但是並沒有提出怎麼去解析晶體結構。這方面，這要是由Lawrence Bragg及William Bragg共同解決，他們通過對X射線譜的研究，提出晶體衍射理論，建立了布拉格公式，並改進了X射線分光計，他們與1915年獲得諾貝爾物理學獎，這位後面的結構學奠定了基礎。

Lawrence Bragg

來源維基百科

後面基於蛋白純化技術的提高，Max F. Perutz及John Kendrew解析了肌球蛋白及肌紅蛋白，他們於1962年獲得諾貝爾化學獎。還有很多都是關於蛋白結構的解析，如核糖體結構的解析以及RNA聚合酶的解析，都是使用類似的方法，X射線晶體衍射方法在結構學方面起了舉足輕重的作用，現在也是很常規的方法。

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DNA是遺傳物質

Kossel分離並描述了存在於核酸中的五種有機化合物：腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶。 這些化合物後來顯示為核鹼基，並且是所有活細胞中發現的DNA和RNA的形成的關鍵。因為這些工作，Kossel獲得了1910年的諾貝爾生理醫學獎。

A，T，C，G，U五種鹼基

但是，Kossel雖然發現了這些東西，人們對於什麼是遺傳物質一直爭論不休，有的人認為是DNA，而另一些人認為是蛋白質，更有甚者，認為糖類是遺傳物質。

噬菌體感染實驗

Hershey及Chase通過噬菌體感染實驗，證明DNA是遺傳物質，而糖類，蛋白質及RNA都不是遺傳物質，基於這Hershey與1969年獲得諾貝爾生理醫學獎，很遺憾，Chase沒有獲得，可能是因為Chase是一位女性，而沒有得到諾貝爾獎委員會的青睞，非常的可惜。

Rosalind Franklin及DNA衍射圖

正是基於這項實驗，導致了大家對於DNA的進一步的研究熱潮，尤其是Maurice Wilkins和Rosalind Franklin（1958年，由於卵巢癌去世，錯失諾貝爾生理醫學獎）使用X射線晶體衍射方法，獲得了DNA的原始結構，而後由James Watson和Francis Crick觀察了衍射圖，他們才提出DNA的雙螺旋結構。

DNA 雙螺旋結構

之後，Watson和Francis Crick提出了DNA雙螺旋模式：一種核酸的構象，在該構象中，兩條反向平行的多核甘酸鏈相互纏繞形成一個右手的雙螺旋結構。鹼基位於雙螺旋內側，磷酸與糖基在外側，通過磷酸二脂鍵相連，形成核酸的骨架。鹼基平面與假象的中心軸垂直，糖環平面則與軸平行，兩條鏈皆為右手螺旋。雙螺旋的直徑為2nm，鹼基堆積距離為0.34nm， 兩核甘酸之間的夾角是36゜，每對螺旋由10對鹼基組成，鹼基按A-T，G-C配對互補，彼此以氫鍵相聯繫。維持DNA雙螺旋結構的穩定的力主要是鹼基堆積力。雙螺旋表面有兩條寬窄`深淺不一的一個大溝和一個小溝。

中心法則

緊接著，在1958年，Francis Crick提出了中心法則，這是在細胞內的生物大分子間轉移的基本法則，指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質，即完成遺傳信息的轉錄和翻譯的過程。也可以從DNA傳遞給DNA，即完成DNA的複製過程。這是所有有細胞結構的生物所遵循的法則。在某些病毒中的RNA自我複製(如煙草花葉病毒等)和在某些病毒中能以RNA為模板逆轉錄成DNA的過程(某些致癌病毒)是對中心法則的補充。正是因為以上的貢獻，到1962年，Maurice Wilkins，Watson和Francis Crick共同獲得諾貝爾生理醫學獎。

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測序方法的發明及應用

測序方法主要涉及蛋白質測序及DNA測序，其中蛋白質測序是由Frederick Sanger 開發完成的，第一個測出了胰島素的氨基酸序列，這項成果於1958年獲得諾貝爾化學獎。Sanger使用了來自劍橋大學化學系的Bernhard Charles Saunders的有毒氣體研究的化學試劑1-氟-2,4-二硝基苯（現稱Sanger試劑，氟二硝基苯，FDNB或DNFB）。

Frederick Sanger

Sanger試劑證明在多肽鏈一端標記N末端氨基有效。然後，他用鹽酸或使用酶如胰蛋白酶將胰島素部分水解成短肽。將肽的混合物在一張濾紙上二維分餾，首先通過一維電泳，然後垂直於另一個色譜法。用茚三酮檢測到的胰島素的不同肽片段移動到紙上的不同位置，形成了Sanger稱為「指紋」的不同圖案。通過FDNB標記賦予的黃色可以識別來自N末端的肽，並且通過完全酸水解確定在肽末端標記的氨基酸的特性，並發現哪一個二硝基苯基 - 氨基酸在那裡。

胰島素結構

通過重複這種類型的程序，Sanger能夠確定使用不同的初始部分水解方法產生的許多肽的序列。然後可以將它們組裝成更長的序列，以推斷胰島素的完整結構。最後，由於A和B鏈在沒有三個連接二硫鍵（兩個鏈間，一個在A上的一個鏈內）是生理上無活性的，Sanger和他們的同事在1955年確定了它們的完整結構。Sanger的主要結論是蛋白質胰島素的兩條多肽鏈具有精確的氨基酸序列，並且通過延伸，每種蛋白質都具有獨特的序列。正是這一成就在1958年獲得了他的第一個諾貝爾化學獎。這個發現對於Crick的後續序列假說來說，對於DNA編碼蛋白質的思想來說是至關重要的。

Sanger測序方法（雙脫氧核苷酸終止法）

DNA測序主要是由Frederick Sanger及Walter Gilbert 共同作出了奠基性的貢獻，他們於1980年獲得諾貝爾化學獎。Frederick Sanger提出了Sanger sequence的方法，也就是雙脫氧核苷酸終止法，現在是主流的方法，應用於各種各樣的測序中，視為測序的金標準。Sanger首先使用這種方法測出了bacteriophage φX174的基因組結構，幸好這物種的基因組不大，否則Sanger也不會選擇這個進行測序。

bacteriophage φX174基因組

Maxam-Gilbert測序是由Allan Maxam和Walter Gilbert在1976 - 1977年開發的DNA測序方法。 該方法基於DNA的核鹼基特異性部分化學修飾，並隨後在與修飾的核苷酸相鄰的位點斷裂DNA主鏈，完成測序。

Maxam-Gilbert測序

Maxam-Gilbert測序，也稱為化學測序，該方法允許使用純化的雙鏈DNA樣品，無需進一步克隆。 該方法使用放射性標記及其技術複雜性阻礙了其進一步大規模的應用，而Sanger方法經過改進後，得到了廣泛使用。

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PCR技術的誕生

提到PCR技術，學習生命科學的，沒有人不會不知道。我們進行PCR反應，Taq DNA聚合酶及PCR儀必不可少。故在這裡主要介紹這倆個概念。Taq聚合酶是一種熱穩定的DNA聚合酶，是一種為嗜熱菌（Thermus aquaticus），最初被我國台灣學者錢嘉韻等人從其中分離出來，這是一種大量擴增DNA短鏈數量的方法。

T. aquaticus是一種住在溫泉和熱液噴口的細菌，Taq聚合酶被鑒定為能夠耐受PCR期間所需的蛋白質變性條件（高溫）的酶。因此，它取代了原始用於PCR的大腸桿菌的DNA聚合酶。Taq的最佳活性溫度為75-80℃，在92.5℃下半衰期大於2小時，95℃為40分鐘，在97.5℃為9分鐘，可以複製1000bp DNA在72℃不到10秒鐘。Taq的缺點之一是缺乏3"至5 核酸外切酶校正活性，導致複製保真度相對較低。原來其誤差率在9,000個核苷酸中約為1。

Taq DNA聚合酶結合DNA

現在已經從具有校正活性的其他嗜熱細菌和古細菌如Pfu DNA聚合酶中分離出一些熱穩定的DNA聚合酶，並且正在使用（或與Taq組合）用於高保真擴增。Taq使具有A（腺嘌呤）的DNA產物在其3 末端突出。這可能在TA克隆中有用，由此使用具有T（胸腺嘧啶）3 突出端的克隆載體（例如質粒），其與PCR產物的A突出端互補，從而使PCR產物連接到質粒載體。

在20世紀80年代初，Kary Mullis在Cetus公司工作，將合成DNA應用於生物技術。他熟悉使用DNA寡核苷酸作為結合目標DNA鏈的探針，以及它們用作DNA測序和cDNA合成的引物。 1983年，他開始使用兩個引物，一個與靶DNA的每條鏈雜交，並向反應中加入DNA聚合酶。這導致指數型DNA複製，大大擴大了引物之間的DNA量。

PCR反應原理

然而，在每一輪複製後，需要將混合物加熱至90℃以上以使新形成的DNA變性，從而允許鏈條在下一輪擴增中分離並作為模板。該加熱步驟還使得在發現Taq聚合酶（來自大腸桿菌的DNA聚合酶I的Klenow片段）之前使用的DNA聚合酶失活。使用熱穩定的Taq可以在高溫（?60°C及以上）條件下進行PCR，這有助於引物的高特異性，並降低非特異性產物如引物二聚體的產生。此外，使用熱穩定聚合酶消除了對每輪熱循環添加新酶的需要。在相對簡單的機器中的單個封閉管可用於執行整個過程。因此，使用Taq聚合酶是使PCR適用於有關DNA分析的各種分子生物學問題的關鍵所在。

PCR測序圖

Hoffmann-La Roche最終以3.33億美元從Cetus購買了PCR和Taq專利， 1989年，「科學」雜誌將Taq聚合酶命名為「年度最佳分子」。 Kary Mullis在1993年獲得諾貝爾化學獎。到20世紀90年代初期，Taq聚合酶的PCR技術被廣泛應用於許多領域，包括基礎分子生物學研究，臨床檢測和取證。它也開始在艾滋病毒直接檢測艾滋病毒方面找到緊迫的應用。

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基因操作技術（包括及RNAi及CRISPR）

RNA干擾（RNAi）是通過降解目標mRNA分子來抑制基因表達或翻譯生過程。Andrew Fire和Craig C. Mello在1998年發表了線蟲幹細胞的干擾工作，他們於2006年共同分享了諾貝爾生理醫學獎。

植物中的RNAi

但是不得不提，RNAi在植物裡面更早的被發現，這也說明諾貝爾獎委員會有時候也不一定會注意到最原創的東西。 RNAi現在被稱為精確，有效，穩定和優於用於基因抑制的反義技術。

RNA干擾

microRNA與siRNA- 是RNA干擾的核心。 RNA是基因的直接產物，這些小RNA可以結合其他特定的信使RNA（mRNA）分子，並且增加或減少其活性，例如通過防止mRNA被翻譯成蛋白質。 RNA干擾在防禦細胞對寄生核苷酸序列（病毒和轉座子）中起重要作用。

動植物RNA干擾的區別

RNAi途徑存在於許多真核生物中，包括動物及植物，並由Dicer酶引發，Dicer將長雙鏈RNA（dsRNA）分子切割成約20個核苷酸siRNA的短雙鏈片段。研究最多的是轉錄後基因沉默，當引導鏈與信使RNA分子中的互補序列相互對應並且通過Argonaute 2（Ago2）（RISC複合物的催化成分）誘導切割時，發生轉錄後基因沉默。在一些生物體中，儘管siRNA的摩爾濃度最初是有限的，但是該方法系統地傳播。

RNAi應用

RNAi是細胞培養和活生物體中有價值的研究工具，因為引入細胞的合成dsRNA可以選擇性地並且強有力地誘導抑制感興趣的特定基因。 RNAi可用於大規模篩選，系統地關閉細胞中的每個基因，這可以幫助鑒定特定細胞過程所需的組分或諸如細胞分裂的事件。該途徑也被用作生物技術，醫藥和殺蟲劑的實用工具。

雖然RNAi應用簡便，但是RNAi始終是在RNA水平上進行操作的，有時候經過幾代遺傳，RNA干擾的效果不會很好，另外，RANi干擾只是knockdown基因的表達，而沒有達到knockout的程度，故也限制了RNAi的進一步應用。現在，出現了一種更powerful的技術，叫做CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技術。

CRISPR組成成分

CRISPR包含已經攻擊細菌的病毒的DNA片斷。這些片段被細菌使用以通過類似病毒檢測和破壞進一步攻擊的DNA。這些序列在細菌防禦系統中起著關鍵作用，並且構成了稱為CRISPR / Cas9的基因組編輯技術的基礎，其允許生物體內的基因永久修飾。

CRISPR種類

CRISPR / Cas系統的簡單版本CRISPR / Cas9已被修改為編輯基因組。通過將與合成指導RNA（gRNA）複合的Cas9核酸酶轉移到細胞中，可以在期望的位置切割細胞的基因組，從而允許去除和/或添加鹼基，進而執行相應的基因編輯功能。

CRISPR應用

CRISPR / Cas基因組編輯技術有許多潛在的應用，已經在動物，植物，真菌等各個物種進行了應用，但是對於人類而言，還存在著倫理學問題，以及需要進一步解決脫靶效應等問題，才能進一步用在臨床方面。

其實，RNAi與CRISPR技術相輔相成，使用CRISPR有時會遇到致死的問題，故只能使用RNAI，只需要使基因表達下調就可以了；但是有時候，對於RNAi出現的問題，CRISPR又可以解決，如knockout基因，遺傳性問題。

後面5項技術，會在近期繼續介紹，敬請關注。

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