諾獎解讀：生物鐘簡史及對新葯研發的啟示

最新 10-05

Jerry發獃

德國藥物化學博士在讀，關注新葯研發領域

什麼是生物鐘？

一、晝夜節律的分子機制

邁克爾·楊（Michael W. Young）的父母出生於美國田納西州東部的諾克斯維爾，1946年他們驅車前往邁阿密度蜜月。與諾克斯維爾的冬季不同，邁阿密的冬季溫暖宜人。短短的幾天他們便愛上了那裡，並選擇在那裡定居。

邁克爾·楊在三年後出生。儘管他家族中從沒有人從事過醫學或者科研相關工作，父母也沒有接受過大學教育，但他們卻非常熱衷於培養孩子對科學的興趣。他們給邁克爾·楊買了顯微鏡和望遠鏡，邁克爾·楊做化學實驗弄髒了家裡的地板他們也完全不在乎。邁克爾楊小時候對機械很感興趣，而且曾經自己製作過卡丁車。

但更讓邁克爾·楊感興趣的是他家的後花園。那裡有各種各樣的動物，美洲蜥蜴、犀鳥、鸚鵡，還有花朵能夠晝開夜合的奇怪植物。十二三歲的時候他的父母給他買了一本關於生物學和進化論的書，書中有一段關於控制花朵生物鐘的描述。書中說對於生物體內的生物鐘組成結構和作用機制我們一無所知。

確實如此。人們很早就觀察到很多生物可以預測並適應環境中的日照變化。18世紀的時候法國科學家Jean Mairan將含羞草置於恆定黑暗的環境下。他發現含羞草的葉片活動仍能保持24小時的波動變化。這次發現也被認為是生物具有內源性節律的最早證據。

含羞草Artist unknown

19世紀的生物鐘研究只停留在植物學，而到了20世紀由於生態學、動物行為學、原生動物學、進化生物學、哺乳動物生理學以及人類生物醫學、農學等學科的發展，人們發現這是存於包括人類在內的多種生物體內的現象。而這個時鐘其實有助於我們為日常的生理機能做好準備。這種規律性的適應被稱為「晝夜節律」。但是人體內部生物鐘的工作原理仍然是個謎。

到了上世紀60年代，生物鐘的研究已經形成了一個細分的領域。1960年舉行的冷泉港會議成了該領域的重要事件，會議後ColinPittendrigh總結了16條生物鐘特性。儘管當時大多數人相信生物鐘是由內在因素導致的，但Frank Brown等人卻相信生物鐘由與地球自轉相關的物質引起的。

如果要研究一個生物體內的體系，那麼我們必須清楚該體系的性質、與此相關的解剖學位置，而且必須闡明它的內在機制。當時已經發現生物鐘幾乎與物理時鐘一樣精準，但卻具有一定的適應性和動態性，而且幾乎所有的真核生物都存在生物鐘。如果要研究生物鐘的內在機制，儘管當時存在爭議，但基因研究仍然是比較好的策略。

二、 Per基因

在上世紀70年代，加州理工學院的Seymour Benzer 和他的學生Ronald Konopka選擇通過研究果蠅來尋找控制果蠅晝夜節律的基因。他們使用致突變劑誘導果蠅生物鐘變化，發現一些果蠅的晝夜節律延長，一些果蠅的晝夜節律縮短，而有的果蠅晝夜節律則完全紊亂。而最重要的是他們發現這些類型的晝夜節律變化都指向了同一個基因。他們給這個新基因起了個名字：per（period, 周期）。那麼這個基因是如何影響節律的呢？

基因的克隆為該問題的解決奠定了基礎。美國布蘭達斯大學的分子生物學教授羅斯邁克爾巴什 (Michael Rosbash) 和遺傳學教授傑弗里霍耳（Jeffrey Hall）是一對籃球場上的好戰友，球場讓他倆經常有機會在一起討論一些科學上的新發現。當Benzer和Konopka發表了他們關於果蠅生物鐘突變種的時候，羅斯巴什和霍耳注意到了這一發現的重大意義，於是他們倆就決定合作來克隆這個果蠅的生物鐘基因。經過了2年多的努力，羅斯巴什和霍耳的實驗室終於在1984年從果蠅中克隆到了per基因。

而邁克爾楊也在同一時期拿到了per基因克隆。1971年邁克爾楊從德克薩斯大學奧斯汀分校畢業，並選擇繼續攻讀博士學位。他當時痴也迷於果蠅的研究，通過隨機誘導果蠅染色體重組來研究其與果蠅存活的相關性，並研究非致死重組的果蠅表型。當他在進行這項研究的時候Ron Konopka 和 Seymour Benzer 報道了果蠅的per基因與晝夜節律的相關性，而邁克爾楊發現在染色體重組過程中曾使該基因產生斷裂。

1978年邁克爾楊成為洛克菲勒大學的副教授，利用分子生物學手段來克隆per基因。而且他的課題組發現將包含per基因的重組DNA注射入含有per突變的動物體內會恢復期晝夜節律，並且發現晝夜節律突變的果蠅體內產生PER蛋白存在功能缺陷。

果蠅 by Adriana Paoletti

接下來在1988年羅斯巴什和霍耳發現PER蛋白具有晝夜變化規律，在1990年又發現per基因轉錄生成的mRNA也具有晝夜節律。所以PER蛋白的濃度會循環變化，其周期為 24 小時並且和晝夜節律相同。之後科學家需要研究的一個重大課題，就是 PER 這個蛋白如何保持穩定的周期變化。羅斯巴什和霍耳提出了一個假說：PER蛋白可以控制per基因的表達:PER蛋白和per基因形成了一個抑制反饋的環路，PER蛋白可以抑制基因合成自己，這樣就形成了一個連續循環的環路。

但這個模型仍然存在幾個問題，比如PER蛋白質只有從細胞質進入細胞核，才能抑制per基因。之後羅斯巴什和霍耳的研究表明每當晚上的時候PER蛋白會在細胞核里積累。但是它是如何進入細胞核的？1994年邁克爾楊發現了第二個節律基因tim (timeless)。tim基因可以編碼 TIM蛋白，同樣為正常節律所需。邁克爾楊發現TIM蛋白會結合到 PER蛋白上，然後兩個蛋白可以一起進入細胞核並且在那裡抑制per基因的活性。

三、完整的機制

羅斯巴什，霍耳以及邁克爾楊的研究闡述了生物鐘的理論基礎，這也是他們拿諾獎的原因。可惜的是Seymour Benzer 和他的學生 RonaldKonopka因已經去世無緣諾獎。在隨後的幾年裡，其他一些分子也被發現。我們將省略該部分的發展歷史，直接敘述生物鐘的分子機制：

1 抑制反饋的環路果蠅分子生物鐘的基礎抑制反饋的環路發生在基因轉錄層面，細胞核內活化的per基因能夠轉錄生成mRNA，PER蛋白能夠穩定存在並且在細胞漿內累積。PER蛋白在夜晚達到最大濃度並進入細胞核。在細胞核內PER蛋白能夠抑制自身基因轉錄。在早晨的時候PER蛋白會降解，幾小時之後所有PER蛋白消失並解除對per基因的抑制，PER蛋白的生成重新開始。

2Per基因的轉錄活化 per基因的轉錄需要CYC和CLOCK蛋白結合到per基因的啟動子才能夠進行。在夜晚的時候CYC/CLOCK複合物能夠結合到啟動子位置並誘導per基因轉錄。而當PER蛋白與CYC/CLOCK複合物直接作用之後會抑制轉錄過程的進行。在早晨的時候PER蛋白分解，接觸對CYC/CLOCK複合物的抑制，轉錄重新開始。

3 PER蛋白與TIM形成複合物 tim基因與per基因都能夠被CYC/CLOCK複合物活化。轉錄生成的TIM蛋白與PER蛋白形成二聚體抑制PER蛋白的降解。PER/TIM複合物進入細胞核與CYC/CLOCK複合物產生直接相互作用並抑制tim與per基因的轉錄。日出之後TIM蛋白會降解並導致TIM蛋白隨之降解。基因的抑制作用解除，轉錄繼續。

4PER蛋白與TIM蛋白降解果蠅doubletime蛋白 (屬於激酶) 通過產生磷酸化誘導PER蛋白降解，在PER蛋白與TIM蛋白結合之後PER蛋白卻無法被doubletime誘導降解降解。日出之後會引起果蠅眼內的感光的隱花色素異構化，並使之活化。活化的隱花色素能夠誘導TIM蛋白降解。由於TIM蛋白降解，PER蛋白無法保持穩定而隨之被降解。突變的doubletime蛋白會導致晝夜節律延長。

生物鐘 by Lance Bifoss

這個過程並不是一成不變的，多種因素能夠對該過程進行精細調控。比如果蠅眼內的感光的隱花色素能夠結合TIM蛋白並誘導其加速分解解釋了光在生物節律調節中的作用。

生物鐘調節

人的細胞晝夜節律與上述過程基本一致：細胞內的晝夜節律通過影響蛋白的合成、轉運、結合以及降解而產生。而生物鐘能夠通過參與晝夜節律分子機制的組分來影響極為眾多的基因與蛋白功能，從而影響人的體溫、血壓、腸胃蠕動、心率、代謝速率、毛髮生長等等一系列過程。雖然在缺乏外界因素的情況下生物鐘能夠獨立運行並保持基本節律，但這並不意味著生物鐘完美無缺不需要修正，相反在某些情況下我們需要重置我們體內的生物鐘。比如光照的變化能夠調節腦內的生物鐘使其能夠與外界的光照同步。但人的生物鐘是調節的呢？

人的下丘腦內存在一對用來掌控人生物鐘的一對神經元從稱為視交叉上核(SCN)，如果對SCN進行電刺激，那麼人的晝夜節律將會以預定的方式產生改變。切除SCN將會消除生理運動、睡眠、飲食的晝夜節律 (人的睡眠不止是受晝夜節律調控)。因為人的一系列行為與日出日落的周期同步，所以日光將會是調節人生物鐘的重要因素。

下丘腦 by Tillian Reeves

這一過程是由下丘腦通過視網膜下丘腦束來完成的。視網膜神經節細胞的軸突與SCN神經元的樹突通過突觸直接相連，而視網膜產生的輸入信號足以對人的晝夜節律產生調節，以適應外界的白晝與夜晚的變化。神經節細胞能夠表達黑視蛋白(Melanopsin)，光照可使該細胞緩慢激活並將信號通過視網膜下丘腦束傳導至SCN，而SCN調節晝夜節律之後將信號通過突觸連接或分泌加壓素將信號傳遞到腦的其他部位併產生一系列變化。

而在此過程中SCN能夠將來源於視網膜的晝夜更替的信息傳遞給松果體。松果體形似松果，位於上丘腦且能夠分泌褪黑素。褪黑素的分泌因SCN導致的松果體活化或抑制而呈晝夜節律變化。研究發現松果體分泌的褪黑素能夠影響多種體內過程。

以上解釋了晝夜節律和生物鐘的基本概念(注意晝夜節律和生物鐘並不等同，生物鐘引起並能夠調節晝夜節律)，那麼生物鐘對人的健康會有什麼影響？

生物鐘的意義

晝夜的更替伴隨著人的一生，是影響人類生活最重要的規律之一。而人也會產生與之適應的睡眠覺醒周期以適應黑夜與白晝的變換。當然生物鐘不僅作用於人的睡眠和覺醒，還能對人的情緒，食慾，心臟功能，免疫系統產生影響。但我們早已對生物鐘的存在熟視無睹，只有在某些特定的情況下我們才能夠感受到他的重要性。

提起生物鐘對人生活的影響，大家首先想到的可能是長途飛行導致的時差(Jet lag)。時差問題不僅可以影響人的睡眠，還可能對人的認知功能產生影響，並讓人變得勞累，易怒，且有可能產生頭痛，消化問題。這正是由於人的內在生物鐘與外在環境時間的錯位導致的。

另一個引起生物鐘紊亂的常見例子是輪班制工作。與時差問題相同，輪班制工作也可能導致包括睡眠障礙在內的一系列問題。但與時差問題不同的是輪班制工作可能會長期進行，所以對身體的影響可能更明顯。流行病學研究發現輪班制與2型糖尿病相關，而且可能導致女性患乳腺癌風險提升，並可能提升其他癌症風險。這可能是由於晝夜節律紊亂影響了褪黑素的腫瘤抑制作用，因此世界衛生組織把輪班制也列為可能致癌因素（probable carcinogen）。輪班工作也可能導致諸如心臟病、高血壓、精神疾病的慢性病疾病加重。

生物鐘 by Fatherly

由於生物鐘能夠影響體內幾乎所有的生理過程，所以藥物療效和毒副作用也會因生物鐘的存在和藥物治療的時點選擇而產生差異，該研究領域被稱為時間治療學（chronotherapeutics）。

人的睡眠習慣一般會有差異，有些人習慣早睡，有些人習慣晚睡。這種習慣一般會長期保持而且通常人們能夠適應這種習慣。但某些因內在原因導致的晝夜節律睡眠障礙確是一種疾病。該類疾病患者通常具有超過24小時的晝夜節律，或者因為晝夜節律功能損傷或傳入/傳出通路受損引起對外界環境變化無法做出反應，而且該晝夜節律睡眠障礙通常是注意缺陷多動障礙的合併病症。

治療

生物鐘紊亂會對人的工作生活和健康產生很大影響，但我們該如何治療生物鐘相關障礙呢？由於時差問題通常只是暫時性的，幾天後癥狀便可自行消失，因此並不需要治療。對於經常長途飛行並且飽受時差困擾的人以及輪班制工作的人，醫生可能會酌情開具類似唑吡坦的短效催眠葯。此外光照或者避光療法在某些情況下可以幫助調節晝夜節律。

對於大多數晝夜節律睡眠障礙患者需要包括特定時間光照/避光，合理睡眠時間計劃，以及藥物干預的多重策略進行治療。藥物的治療包括褪黑素，莫達非尼等藥物。莫達非尼用於治療睡眠喚醒障礙的作用機制尚不清楚。

褪黑素是一種內源性激素，即使你沒聽過這個名詞，你肯定也聽過一句廣告詞：今年過節不收禮，收禮只收XXX：褪黑素正是該產品的主要成分。褪黑素在美國和加拿大是非處方葯，在中國則作為保健食品銷售，在其他一些國家，褪黑素可能需要憑處方使用或者處於未批准狀態。褪黑素由視網膜、眼部晶狀體、胃腸道及松果體中的松果體細胞生成。松果體產生的褪黑素是內分泌荷爾蒙會進入血液，視網膜和胃腸道則產生旁泌性荷爾蒙。下丘腦的視交叉上核會由視網膜接收每日光暗的規律，從而影響褪黑素的製造。

褪黑素治療睡眠障礙疾病的作用存在一些爭議，而在癌症、癲癇、繼發性痛經以及精神錯亂等疾病領域沒有合理的臨床證據支持其有效性。褪黑素在動物體內的主要生物作用是通過活化褪黑素受體產生的。而其他如線粒體或細胞核保護作用則基於其抗氧化作用。

褪黑素引發的怪夢 Artist unknown

褪黑素受體屬於G蛋白偶聯受體家族，人體內主要存在兩種亞型MT1和MT2。MT1能夠表達於SCN，參與生物鐘的調節過程。MT2受體則可表達於視網膜。雖然褪黑素具有一系列的生理作用，並且有證據支持其治療作用，但其葯代性質不佳，比如首過效應強，半衰期短從而限制了它的療效和應用。基於其信號通路而開發藥物能夠幫我們找到比褪黑素本身活性更高，選擇性更好，葯代性質更佳的藥物。

新葯

由於存在內源性配體，因此可以利用褪黑素為模板來設計新的化合物。已上市的藥物都能夠對兩種受體產生作用。1986年開始褪黑素受體激動劑的作用研究就已經開始，但到目前為止仍未完全理解，褪黑素受體激動劑與受體結合後會影響一系列生理過程。而藥物開發的適應症主要集中於睡眠障礙。

雷美替胺是第一個上市的褪黑素受體調節劑，其半衰期約為1-2小時，明顯長於褪黑素的20-30分鐘。阿戈美拉汀是第一個上市的治療重度抑鬱的褪黑素受體調節劑，相比其他類型的抗抑鬱藥物，阿戈美拉汀不會產生停葯綜合症和導致性功能障礙(關於該化合物的研發過程可閱讀文末參考文獻中Nature Reviews Drug Discovery的精彩文章 doi:10.1038/nrd3140)。2013年FDA批准另一個褪黑素受體激動劑他司美瓊上市用於治療完全失明患者的晝夜節律睡眠障礙(非24小時障礙)。

已上市褪黑素受體通路相關藥物

由於褪黑素所參與的信號通路影響極為廣泛，所以褪黑素受體調節劑的潛在治療領域不只局限於睡眠障礙，還包括疼痛，炎症，心血管疾病，中樞神經系統疾病以及癌症或者代謝類疾病等等。但大多數褪黑素受體調節劑是上世紀八九十年代合成的，現在該領域的研發並不活躍。

褪黑素受體主要有MT1和MT2兩種受體(MT3為低親和受體)，它們在體內的多種組織內表達，要確定每種受體的特性和具體參與的過程也比較困難。未來MT1/MT2選擇性抑製劑的開發可能會佔主導，但我們必須站在對褪黑素受體通路深刻理解的基礎上才能更好的幫助我們開發新的藥物，拓展新的適應症。

結語

已故的Seymour Benzer和Ronald Konopka以及今年獲得諾貝爾獎的三位科學家對於晝夜節律的分子機製做出重要貢獻，但我們不應該忘記無數參與晝夜節律/生物鐘研究，以及相關的新葯研發的科研工作者。科學的重大進展並不是憑一己之力就能完成的，在表彰三位獲獎者的同時，我們並不能忘了背後默默奉獻的其他人。

最後還應該感謝很多科學家的摯愛：果蠅。