2017年諾貝爾化學獎「冷凍電鏡的開發」！
2017諾貝爾獎化學獎
「冷凍電鏡的開發」
今年的諾貝爾化學獎相比於去年頒發給分子機器來說更出人意料，這一次頒發給了【冷凍電鏡】，屬於分析化學研究領域。
chem-station在Chem-Station版·諾貝爾化學獎候補List【2017年版】裡面也列到了冷凍電鏡的開發，然而估計壓中的人不多。
有人戲言說「這是一個發給了物理學家的諾貝爾化學獎，獎勵他們幫助了生物學家。。。」
玩笑話就不多說了，接下來讓我們一起看一下關於冷凍電鏡的一些內容。
近年來的hot topic！低溫電子顯微鏡（冷凍電鏡）
對於結構生物學的研究目標來說，應該精密解析以蛋白質為代表的生物大分子的三維結構，幫助人們理解一些生命現象並且有效應用來推動社會的進步。而所謂的成果，最直接最明了的應用，也就是醫藥開發。由於基本上所有的藥品都是以與生物體內分子相互作用，以體內的一些蛋白質受體為靶點進行設計的。而如果能夠詳細了解生物體內的一些蛋白質靶點的結構的話，那麼就非常有助於一些新葯的設計。
而在原子級別的生物大分子的結構解析的分析手法來說，在早前主要只有兩種，X射線單晶衍射（XRD）與核磁共振（NMR）。
但是這種局限也在近年來被慢慢打破，開始出現第三種結構解析法，也就是今日的主角冷凍電鏡（Cryo-Electron Microscopy, Cryo-EM）登場了。冷凍電鏡作為第三種結構解析法。而其普及速度也是相當迅速，到2016年為止，1000個中就有1個是由電子顯微鏡解析結構的（下圖所示）。
2000年以後，電子顯微鏡進行的結構解析實例繼續發展（引用於[Nature 2016]相關論文）
冷凍電鏡就如它的名字，蛋白質sample的水溶液在極低溫度下冷凍，用電子顯微鏡進行測定，解析結構。
而普通的電子顯微鏡的測點一般都在高度真空的狀態下進行。如果由於空氣中的分子引起電子射線的反射，那麼會妨礙解析的清晰度與準確性。但是對於生物體內的大分子來說，大部分都是在水中發揮功能的，在真空中解析的話，其科學上的意義就大大降低了。另外生物大分子直接暴露在電子射線中，很容易失活，結構發生變化。
所以，把sample在極低溫?冷凍的狀態下測定的話，這一方面的問題就會得到很大程度的解決。
冷凍電鏡的優勢
冷凍電鏡的飛速發展其實是在有一些問題用現有的兩種解析法無法解決這樣的大環境下實現的。
XRD的問題是，「必須得到化合物的晶體」「必須是均勻的樣品」這兩個限制。所以對於技術的成熟度要求很高，如果能夠得到比較好的晶體，那麼基本上就沒有什麼大的阻礙，能夠得到高分辨（1～2?），清晰的結構圖像。
NMR的問題是、「無法直接得到三維結構」「無法解析巨大分子?複合體（>30kDa）」。基本上就是這個原子大概在這個區域，都是一個比較大概的結果。或者確定一些特徵局部分子在某個局部區域。而其優點是「可以檢測出溶液狀態下的結構」「可以追蹤分子的動態舉動?相互作用」
而冷凍電鏡有哪些優點呢？如下所示
在冷凍水中，與生物體內環境相近的狀態下測定
可以解析巨大的蛋白質或複合體
在極低溫下測定，可以避免電子射線對樣品的破壞
樣品不需要結晶，所以也不需要均勻的樣品為前提
所需的樣品的量極少（濃度在0.1-5.0 M就足夠了）
可以解析蛋白質的各種區域
由於上述優點，特別是對結晶化特別困難的膜蛋白的結構解析來說，冷凍電鏡具有壓倒性的優勢，所以自從其發展以來，很多膜蛋白質的結構都是由冷凍電鏡解析的。
2015年被解析的膜蛋白質結構與所用分析法的關係圖（引用自[Nature 2016]相關論文）
阻礙冷凍電鏡發展的瓶頸
而利用電子顯微鏡在原子解析度級別進行結構解析的報道早在1995年就有報道了（可以解析100 kDa以內的大分子）。而為什麼到最近不久才飛速發展起來呢？
主要原因是：樣品的二維投影圖像的對比度非常低。
也就是說由於周圍的水分子造成的電子散亂等無法避免干擾的發生。如果使用強電子束，雖然對比度將會變強、然而對於樣品的損害也是致命的。所以對樣品既不造成損傷，並且也能夠順利解析的電子射線是必要的。在這個前提下，為了得到足夠的對比度的成像圖，就必須先拿到數千~數萬，甚至數十萬的投影圖像後，再進行平均化。
所以因為上述問題，在利用電子顯微鏡進行結構解析的研究初期，都是用具有對稱性的分子，或者是巨大的複合體（如核糖體和病毒衣殼）為對象進行研究的。但是，在2011年後的五年間，由於硬體/軟體的大幅改進，冷凍電鏡本身也大大進化了。
首先在硬體方面，電子檢測相機性能大大提高了。
2000年代初期使用的電子檢測器，對入射電子的檢測率只有1/5。而2012年開發出的新型產品，可以提高到1/2。另外加上搭載有連射功能的快速圖像捕捉技術，從而大幅降低了干擾。同時，在迅速取得的多個2維投影圖像中，選出對比度好的圖像進行結構再構成，提高了解析度。
在軟體方面，改進了一種用於恢復二維投影圖像的演算法。
對於冷凍電鏡的樣品，都是具有各種結構的蛋白質或者複合體。因此對於這種混合物，通過二維投影圖像向三位結構再構成的過程中，要運用一定的演算法。而利用統計學對data進行分類的演算法在2011年被採用，大幅提高了原子級別的解析度。
除了以上兩點，再加上配備有改良過性能的電子檢測相機（2013），即使不是專家也能很容易的利用圖像分析演算法進行結構解析（2012），因此2014年以後，有很多研究group參入這項領域，從那時候器蛋白質複合體的結構解析的論文就不斷增多。其中比較具有年代代表性的是分子量200kDa以下的小蛋白質複合體的結構解析（2015），最大2 ?解析度的結構解析（2016）。
綜上，其實冷凍電鏡的發展多虧了近年來機械部品的小型化?高性能化、IT技術的發展。
本次諾貝爾化學獎得主們的業績
接下來就來看一下三位諾獎得主各自的貢獻
Richard Henderson在博士期間研究的是X單晶衍射的結構解析。也就是運用X單晶衍射對蛋白質成像。但是上述方法無法用於解析穿透細胞膜的膜蛋白的解析。
Henderson開發出了將膜蛋白與膜一起放置在電子顯微鏡中，同時用葡萄糖溶液作為保護液避免乾燥，用弱電子束一邊照射一邊用電子顯微鏡觀察的手法。利用以上方法進行了細菌視紫紅質的二維結晶的電子衍射實驗工作，雖然最初觀測到的是模糊的圖像（解析度7?），但是從該圖像確定了細菌視紫紅質是由7個α螺旋結構穿透膜蛋白。15年後，在不斷地摸索，改善後，終於首次觀測到了原子級別的細菌視紫紅質的結構。這是電子顯微鏡在蛋白質觀測，解析領域的最高的成果。並且證明了冷凍電鏡與X射線單晶衍射一樣，可以達到解像度3?的成像觀測。
Henderson解析的細菌視紫紅質的立體結構
該成果揭示出細菌視紫紅質膜蛋白在膜中具有相同的排列方向。然而並不是所有的蛋白質都如細菌視紫紅質膜蛋白一樣的朝向，所以該方法沒有一般性。
接下來就輪到Frank博士開發的成像解析法登場了。調配樣品的過程，蛋白質的朝向是雜亂無序的。先用電子射線照射取得多個二維圖像，然後把相似軌跡的高分辨凸顯用電腦重建，然後把重建的二維圖像的相關性進行計算，重建出三維圖像（下圖所示）。
也就是說把數千，數萬枚凸顯通過電腦解析處理，得到「大概就是這樣的分子結構模型吧」的結論，這種圖像解析的演算法被稱為單粒子重構法。
Frank開發的分析方法
Henderson用葡萄糖溶液防止電子顯微鏡造成的樣品的乾燥，而這種方法對於水溶性的蛋白質是不可取的。有很多研究人員把水凍成冰後進行嘗試，發現冰的結晶會造成電子束的散亂，無法得到清晰的蛋白質成像圖。Dubochet提出「不形成冰晶體，做成玻璃台冰包埋樣品不就行了？」的設想。Dubochet把含有水分的樣品貼在金屬網上形成薄膜，扔進被液氮冷卻到-190℃的乙烷中，形成非晶體化的「玻璃狀的水」。利用該方法製作樣品十分簡便，也是現在的冷凍電鏡的基礎，對多種生物體大分子的結構確定起到了巨大貢獻。
Dubochet開發的樣品調配方法
通過觀察下圖所示的冷凍電鏡的發展年表、我們可以清晰的看到這三位諾獎得主做出的巨大貢獻。
（引用於[Nat. Methods 2016]相關論文）
冷凍電鏡存在的一些問題
到目前為止，小編一直在說冷凍電鏡的優勢，大多事情都具有兩面性，而冷凍電鏡也一樣。其問題是：
很貴！
由於要提供原子級別的解析度，因此必須使用很高性能的電子顯微鏡。同時發射電子束時的電壓強度與解析度有直接關係，為了達到原子級別的解析度，需要200kV的電壓。因此好的設備一般需要數千萬至上億人民幣。
數據量巨大
1天囤積的數據量就有幾個TB，保管上存在很大的問題。另外為了解析這麼龐大的數據量，就需要非常高性能的電腦。基本上得用到雲計算。
說白了，就是誰錢多。。。誰就用得起。。。
看來這樣的冷凍電鏡設備並不是所有的研究機構都可以輕鬆的購買、安裝、測定的分析儀器，在今後，冷凍電鏡使用的局限性會如何改進，成為一種普及的分析手段，也正是現在該領域的研究者們的興趣和努力方向。
相關論文
Rafael Fernandez-Leiro and Sjors H. W. Scheres, 「Unravelling biological macromolecules with cryo-electron microscopy.」Nature2016,537, 339. doi:10.1038/nature19948
Eva Nogales, 「The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique」Nat. Methods2016,13, 24. doi:10.1038/nmeth.3694
岩崎憲治，「新時代：クライオ電子顕微鏡による近原子分解能での解析」領域融合レビュー2016,5, e010. DOI: 10.7875/leading.author.5.e010
相關書籍
The Resolution Revolution: Recent Advances In cryoEM (Methods in Enzymology)
PublicationDate2016/08/26
Kindle版411 pages
PublisherAcademic Press
※Chem-Station版?諾貝爾化學獎候補List2017年版
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