迷上生物鐘之二：藍綠細菌的生物鐘，「另類」還是「先驅」？

藍綠細菌（或稱為藍藻）細胞

「迷上生物鐘」系列第1篇：植物進化最聰明的機制，人類如何改造利用？

撰文 | 秦曦明 （安徽大學物質科學與信息技術研究院，中國細胞生物學學會生物節律分會委員）

責編 | 徐 可

知識分子為更好的智趣生活ID：The-Intellectual

瑞典皇家科學院宣布將2017年諾貝爾生理學或醫學獎授予傑弗里·霍爾(Jeffrey C. Hall)、邁克爾·羅斯巴什(Michael Rosbash)、邁克爾·揚(Michael W. Young)，以表彰他們在近日節律（Circadian rhythms，人們通常也稱其為生物鐘）研究中取得的成就。他們用果蠅作為模式生物，克隆得到第一個生物鐘基因，period（周期基因），並且發現周期基因所表達的周期蛋白會在晚上積累，白天則會降解，周期蛋白濃度會隨著晝夜節律呈現規律性的24小時周期變化，從而提出控制近日節律的分子機制，轉錄翻譯負反饋環路。

2017年諾貝爾生理學或醫學獎得主傑弗里·霍爾、邁克爾·羅斯巴什、邁克爾·揚

看到這個獎項的頒布，我為三位前輩高興的同時，想起了生物鐘領域中的「另類」成員，藍綠細菌（或稱為藍藻）的生物鐘，一個不以轉錄翻譯負反饋環路驅動生物鐘運行的分子機制。當然，「另類」或是凡夫俗子們對藍綠細菌生物鐘的看法。有人則視其為生物鐘研究的「先驅」，一如現代遺傳學之父孟德爾的遺傳定律當年並不能被人理解，直到20世紀，人們才能理解「孟德爾遺傳定律」的意義。

人們對自然界的生物存在一個內源的生物鐘的認識由來已久，但一直認為生物鐘僅存在於高等生物中，因為大多數高等生物的細胞分裂周期接近24小時，正好與生物鐘的周期相近，而對於分裂時間遠小於24小時的原核生物（例如大腸桿菌的分裂速度可以快至20分鐘一代），人們不假思索地就排除了其存在晝夜振蕩的生物鐘。但是，研究藍綠細菌的科學家發現，固氮反應與氧氣的存在是不相容的，而藍綠細菌是地球上進行光合作用最大的物種群之一。就有人們開始推測，藍綠細菌的固氮反應與光合作用發生於一天中不同的時間（即生物鐘常常所說的相位）。不久，這個猜想得到證實，海洋藍綠細菌聚球藻(Synechococcus)的光合作用在白天進行，而固氮作用在夜間進行，並且是內源存在的[1]，這是典型的生物鐘現象。

此時，卡爾·約翰遜(Carl H. Johnson) 完成了他在伍德蘭德·黑斯廷斯（Woodland Hastings，美國科學院院士、海洋生物學及生物熒光領域專家）實驗室的博士後研究，來到范德堡大學(Vanderbilt University)開展他的研究工作。眼光敏銳的約翰遜注意到了被人們忽視的藍綠細菌，很快他就與世界頂尖的兩位科學家，分子遺傳學家蘇珊·戈爾頓(Susan S. Golden)和植物生理學家近藤孝南(Takao Kondo)，以藍綠細菌為模式生物開始了合作。他們三位1998年在Science上發表的文章中，克隆了重要的藍綠細菌生物鐘基因：kaiA，kaiB和kaiC。並且，基於霍爾和羅斯巴什在90年代初提出的轉錄翻譯負反饋環路理論，他們提出藍綠細菌生物鐘運行的負反饋分子模型[2]。而高等哺乳動物的第一個生物鐘基因，clock（鍾基因），剛剛於1997年被約瑟夫·高橋(Joseph S. Takahashi)克隆得到[3]。

卡爾·約翰遜、蘇珊·戈爾頓、近藤孝南

天下沒有不散的宴席，三個合作良好的科學家選擇了「分家」，一個做生物鐘的輸入信號，一個做生物鐘的輸出路徑，一個做生物鐘的分子機制。時間過得很快，其間生物鐘領域的成果層出不窮，每年的會議報告都讓聽眾興奮不已。2005年，近藤孝南課題組在Science雜誌發表了震動世界生物鐘甚至生物學領域的成果，完全拋開了「轉錄翻譯負反饋環路」理論，報道了一種簡單至極的生物化學反應，解釋了藍綠細菌生物鐘的運行本質[4]。

簡單來說，近藤教授的課題組發現，原先認為要通過負反饋才能振蕩的三個生物鐘組分可以通過純粹的生化反應產生振蕩。KaiA，KaiB和KaiC三種蛋白混合在一起，無需轉錄和翻譯過程，在能量供體（ATP）存在的情況下，KaiC蛋白的磷酸化會展現出近日節律振蕩。KaiC的磷酸化位點有2個，分別是431位的絲氨酸和432位的蘇氨酸。讀者可以從下面的蛋白電泳膠圖中看到KaiC蛋白的動態磷酸化變化，其中KaiC蛋白的四條蛋白電泳條帶的周期變化接近24小時（上面的三條帶是磷酸化的KaiC）。這個發現非常完美，將沒有生命的化學分子變化和生命現象（24小時的生物鐘）聯繫在一起，體現了生命的本質。

KaiC蛋白的動態磷酸化呈現周期性變化規律。來源：秦曦明

約翰遜和同在范德堡大學的馬丁·艾格里(Martin Egli)展開合作，純化並結晶了藍綠細菌的KaiC蛋白，順利解析其三維結構，是一個完美對稱的正六聚體，從頂部看上去，像一個完美的時鐘。隨著近年冷凍電鏡技術（2017年諾貝爾化學獎）的發展，更高解析度的KaiC及其與KaiA和KaiB複合物的結構得到解析，為理解KaiC磷酸化的近日節律提供了清晰的注釋[5]。下圖的中心是正六聚體的KaiC蛋白，每個KaiC亞基結合1個KaiB單體，再結合2個KaiA單體，組成對稱結構。

KaiCBA複合物的三維結構示意圖。PDB ID：5N8Y

至此，藍綠細菌生物鐘作為一個從轉錄翻譯負反饋環路模型的「局內人」，完全成為自成一體的「不依賴轉錄的生化振蕩器」。本屆諾貝爾生理學或醫學獎得主，羅斯巴什，認為藍綠細菌的生物鐘與高等生物的進化起源不同。但是科學家基於藍綠細菌的發現，近年在高等生物里發現了不依賴轉錄翻譯負反饋環路的近日節律振蕩[6]，為生物機體生物鐘的統一認識打開了一扇新的窗戶。

誰又能斷言，藍綠細菌的生物鐘運行的不依賴轉錄翻譯的分子機制，會不會如同愛因斯坦在1916年所提出的引力波概念（2017年諾貝爾物理學獎，但受到物理學家幾十年的質疑），在未來被發現是統一存在於所有的生物機體之中。

參考文獻：

1. Mitsui A, Kumazawa S, Takahashi A, Ikemoto H, Cao S, Arai T. (1986) Strategy by which nitrogen-fixing unicellular cyanobacteria grow photoautotrophically. Nature. 323: 720-722.

2. Ishiura M, Kutsuna S, Aoki S, Iwasaki H, Andersson CR, Tanabe A, Golden SS, Johnson CH, Kondo T.(1998) Expression of a gene cluster kaiABC as a circadian feedback process in cyanobacteria. Science. 281:1519-1523.

3. King DP, Zhao Y, Sangoram AM, Wilsbacher LD, Tanaka M, Antoch MP, Steeves TD, Vitaterna MH, Kornhauser JM, Lowrey PL, Turek FW, Takahashi JS. (1997) Positional cloning of the mouse circadian clock gene. Cell. 89: 641-653.

4. Tomita J, Nakajima M, Kondo T, Iwasaki H. (2005) No transcription-translation feedback in circadian rhythm of KaiC phosphorylation. Science. 307: 251-254.

5. Snijder J, Schuller JM, Wiegard A, L?ssl P, Schmelling N, Axmann IM, Plitzko JM, F?rster F, Heck AJ. (2017) Structures of the cyanobacterial circadian oscillator frozen in a fully assembled state. Science. 355:1181-1184.

6. O'Neill JS, Reddy AB. (2011) Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469: 498-503.

製版編輯： 艾略特｜

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