MIT美女科學家利用多重Crispr基因編輯技術建立癌症葯篩新模型

今天是2017年10月8日

農曆八月十九

醫麥客：多重CRISPR技術解決癌症研究難題

2017年10月8日/醫麥客 eMedClub/--癌症研究過程中一個主要的挑戰是為新療法開發強大的臨床前藥效評價模型，這些模型將準確反映人類對新葯的反應。通常，在細胞或動物模型中最初看起來很有希望的潛在治療，往往應用到癌症患者身上時反而效果不佳。

鑒於臨床試驗的巨大成本，研究人員迫切需要一種能夠準確反映人類疾病遺傳信息的臨床前研究模型，這些模型可靠地預測哪些藥物最有可能讓患者受益。

Zuzana Tothova

本周在Cell Stem Cell上發表了一項關於潛在臨床前評價新模型的研究。該研究由Zuzana Tothova博士領導的團隊完成，他是麻省理工學院和哈佛大學的博士後，研究員，Dana-Farber癌症研究所（DFCI）的醫學教授，另外的成員還有Broad研究所的Ben Ebert教授，他是哈佛醫學院的教授、DFCI醫學腫瘤學主席。

Zuzana Tothova博士說：「使用多重CRISPR技術了對人造血幹細胞進行基因編輯，隨後移植進入小鼠中，定製生成的這種小鼠模型可用於白血病的研究。在許多不同的實驗中，動物模型可以成功的反映用於治療血液腫瘤製劑的反應。 而通過我們的模型，可以在正確的環境中以非常受控的方式進行測試，並使用正確的細胞，這些細胞包含了對特定藥物反應的遺傳預測基因。」

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從疾病的遺傳信息中找到癌症驅動基因

研究小組開始研究Ben Ebert實驗室和「癌症基因組圖譜」中的大規模測序數據，以確定哪些組合突變最常見於骨髓增生異常綜合征（MDS）、急性骨髓性白血病（AML）以及骨髓衰竭的血液癌症。通過數據分析，研究人員最後將目標放在MDS和AML兩中疾病中經常突變的9個基因。

Ben Ebert解釋說：「通過類遺傳學的研究，我們知曉了哪些突變組合會導致癌症。 如果我們有足夠的腫瘤測序數據，就可以確定突變基因以及那些突然發生的偶然突變組合。

目前，許多癌症模型（如細胞系）不反映特定研究者想要研究的癌症遺傳學背景，這往往使研究人員和患者均處於不利地位。一種策略是將實際的人類癌症組織移植到小鼠中（PDX模型），但是癌組織通常不能很好地植入，研究人員只能夠針對特定癌症樣本中累積的突變的特異性組合進行測試。

為了綜合研究這些特定的驅動MDS發生的突變基因，該團隊開發出一種新方法將其插入到新的實驗室模型中。

Tothova說：「通過對癌症測序工作的深度分析，我們正在嘗試開發一種針對特定突變組合的新葯評價方法。 您可能沒有任何樣品可用於特定突變組合的研究，我們希望能夠設計人體細胞中的正確病變，讓其在小鼠中擴增，併產生準確的疾病遺傳模型以測試對新葯的反應。這是癌症研究人員和製藥行業一直以來都期望達到的目標。」

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多重CRISPR基因編輯技術定製癌症突變

為了創建具有正確突變的模型，Tothova和她的團隊建立了一個可定製的系統，將癌症的驅動突變引入MDS和AML起源的人類造血幹細胞中。這些研究人員已經在造血幹細胞和祖細胞方面有廣泛的經驗，細胞主要來自臍帶血或成人骨髓。並且在2014年，他們在Nature Biotechnology（自然生物技術）上發表了一篇論文，用CRISPR-Cas9的編輯方法創建相似的小鼠癌症模型。這一次，該團隊的目標是在人體細胞中建立MDS，這是一個更具挑戰性的目標。

研究人員從健康供體中採集原代細胞，並使用多重CRISPR技術對其進行多個不同突變組合的編輯，而不是單一基因的改變，以反映患者腫瘤突變的複雜性。這些突變的組合要是細胞可耐受的，也就是說是一種成功地改變基因而不殺死細胞的突變組合，並且隨著時間的推移，細胞擴增後還能觀察到這些突變。

到目前為止，還沒有人用多重CRISPR技術對人造血幹細胞進行編輯，添加特異性突變以產生疾病模型。之後，研究人員將編輯過的幹細胞注入小鼠的血液循環系統，其中一部分進入骨髓。該小組在五個月後監測其進展情況，然後提取細胞進行測序，以確定這些編輯後的細胞已經成功繁殖。

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藥物測試新模型

MDS患者的主要治療方法是使用azacitidine和地西他濱的低甲基化劑。基於以前的研究，該團隊確定了可用於預測癌細胞對這些化合物反應的特定遺傳突變。（例如，稱為TET2的基因中的突變可預測MDS患者是否治療成功，而ASXL1基因突變則預測腫瘤是否發生耐葯）。

研究人員用azacitidine處理小鼠時，發現這些基因工程編輯細胞的反應與人類的數據預期相符：TET2突變細胞對藥物有反應，而ASXL1突變的細胞對治療有耐藥性。該團隊還發現，凝血酶基因SMC3中的突變增加了對藥物的敏感性。

Tothova說：「我們能夠概括出人類臨床試驗中以前的發現，這使我們對這些模型的價值更有信心。 來自患者的測試數據反映了我們試圖理解的最重要的實驗。」目前她正在與DFCI的臨床研究者合作，計劃將其中一些發現應用到臨床試驗中。

該團隊認為，只要可以選擇適當的突變的測序數據，同時可以從期望的組織中獲取祖細胞，就可以將血液腫瘤中的測試方法應用到其他類型的癌症。Zuzana Tothova博士說：「現場的人們對這些模型很渴望，我們正在分析正確的細胞背景，然後對疾病進行建模，我們期望其帶有的遺傳複雜性能夠直接反映我們在患者中看到的一樣，這在以前沒有人可以完成，我們深信可能成為一個非常有益的工具。」

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多重CRISPR基因編輯技術

CRISPR是規律成簇的間隔短迴文重複（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的縮寫。CRISPR與內切酶Cas9組成的防禦系統讓細菌對抗外來侵略者。CRISPR-Cas9能夠在引導RNA的指引下，靶標並切割入侵者的遺傳物質。此後研究者們利用這一特點，將CRISPR系統發展成了強大的基因組編輯工具。

Cpf1系統（圖片來源：Nature Biotechnology）

CRISPR/Cas9是繼ZFN、TALEN之後出現的第三代「基因組定點編輯技術」，這幾年成為生物技術領域的熱點。在科研領域，它已展現了巨大的潛力，並幫助科學家們建立了一個個不同的疾病模型，讓我們了解特定基因的重要性。而多重CRISPR技術也是去年紅極一時的基因編輯新技術。

張鋒（圖片來源：n.cztv.com）

2015年9月

以張鋒教授研究團隊為主的科學人員報告了一種新的CRISPR效應分子Cpf1，該研究以「Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System」為題發表在2015年九月的cell雜誌上。他們證明Cpf1具備介導強大的DNA干擾並且不同於Cas9的功能。

黃志偉教授（圖片來源：科技日報）

2016年4月

來自哈爾濱工業大學生命學院的中國科學家黃志偉教授團隊在Nature在線發表了題目為「The crystal structure of Cpf1 incomplex with CRISPR RNA」的研究論文。該項研究通過結構生物學和生化研究手段揭示了CRISPR-Cpf1識別CRISPR RNA （crRNA）以及Cpf1剪切pre-crRNA成熟的分子機制。

Emmanuelle Charpentier（圖片來源：discov-her.com）

2016年4月

來自德國馬克斯普朗克感染生物學研究所的Emmanuelle Charpentier博士也在Nature上在線發表了題為「The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA」的研究論文。

該項研究描述了Cas9的一種潛在替代者，來自土拉熱弗朗西絲菌（Francisella novicida）的CRISPR結合蛋白Cpf1的特徵：Cpf1具有雙重切割活性，不僅切割DNA，而且也切割RNA。與CRISPR-Cas9不同的是，Cpf1能夠獨自地對pre-crRNA進行加工，然後利用加工後產生的crRNA特異性地靶向和切割DNA，因而也就不需要來自宿主細胞的核糖核酸酶（RNase）和tracrRNA，這是人們迄今為止發現的一種最簡單的CRISPR免疫系統。這一發現可能給科學家們提供一種新的序列特異性基因組編輯方法，更為重要的是，還可能便於一次對多種靶位點進行編輯，即所謂的多重編輯。

2016年12月

張鋒所在的Broad研究所和Wageningen大學的John van der Oost教授在Nature Biotechnology上發表題為「Multiplex gene editing by CRISPR–Cpf1 using a single crRNA array」的研究，實現了CRISPR的一項新突破，即利用CRISPR–Cpf1打造了一個多重化基因編輯系統。

參考出處：

https://medicalxpress.com/news/2017-10-crispr-engineered-cancer-therapeutics.html

http://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(17)30373-9

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