冷凍電鏡解析生物分子結構最新研究進展

本文系生物谷原創編譯，歡迎分享，轉載須授權！

2017年10月4日，瑞典皇家科學院在斯德哥爾摩宣布將2017年度諾貝爾化學獎授予給瑞士洛桑大學的Jacques Dubochet、美國哥倫比亞大學的Joachim Frank和英國劍橋大學分子生物學實驗室的Richard Henderson，獲獎理由是「開發出冷凍電子顯微鏡技術（cryo-electron microscopy, 也稱作electron cryomicroscopy, cryo-EM, 也稱為低溫電子顯微鏡技術）用於確定溶液中的生物分子的高解析度結構。」

因為冷凍電子顯微鏡技術的出現，我們能看到的微觀世界從圖片左側的樣子，變成了右側這樣。圖片來源：The Royal Swedish Academy of Sciences | 製圖：Martin H?gborn

基於此，小編對利用冷凍電鏡技術解析生物分子結構近期取得的進展進行一番盤點，以饗讀者。

1.Science：解析出AMPAR-stargazin複合體的三維結構

doi:1126/science.aaf8411

AMPA離子型谷氨酸受體（AMPA-subtype ionotropic glutamate receptor, AMPAR）調節快速的興奮性突觸傳遞，促進更高級的認知過程，如學習和記憶。在大腦中，AMPAR與多種輔助性亞基形成蛋白複合體，其中這些輔助性亞基嚴格控制著AMPAR的運輸、門控和藥理作用。這些蛋白複合體遭受破壞與多種精神疾病和神經退行性疾病有關。

在一項新的研究中，Edward C. Twomey等人利用低溫電鏡技術 （ Cryo-Electron Microscopy ）解析出一種與stargazin（STZ）結合時的AMPAR的三維結構，其中STZ是一種代表性的跨膜 AMPAR調節蛋白。STZ控制著AMPAR的突觸靶向、突觸可塑性和區室特異性的活性、藥理作用和門控。

2.Nature：重大突破！史上最詳細人DNA轉錄前起始複合體結構出爐！

doi:10.1038/nature17970

作為所有生命必不可少的一個過程，基因表達分兩步：DNA轉錄為RNA，然後RNA翻譯為蛋白。

在一項新的研究中，來自美國喬治亞州立大學、加州大學伯克利分校和西北大學等多家機構的研究人員將低溫電鏡技術（Cryo-EM）和最新的計算建模方法結合在一起，史無前例地詳細解析出 近原子解析度下的人轉錄前起始複合體（transcription pre-initiation complex, PIC）的分子結構。人PIC是一個蛋白組裝體，將RNA聚合酶安排在合適的位置從而確保能夠啟動轉錄。

這些新的結構有助深入認識在轉錄起始整個過程---包括識別基因轉錄開始啟動的DNA啟動子區域、打開這個啟動子區域和起始轉錄---中人PIC發生的一系列構象變化。相關研究結果於2016年5 月11日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Near-atomic resolution visualization of human transcription promoter opening」。

在這個緊密控制的轉錄過程開始時，RNA聚合酶和一般轉錄因子（general transcription factor）在DNA的特定位點上組裝在一起而形成PIC。這種PIC組裝是打開啟動子的雙鏈DNA螺旋結構從 而將DNA放入在RNA聚合酶活性位點上和開始轉錄過程所必需的。所產生的mRNA轉錄本然後就被用來製造蛋白。

為了獲得人PIC複合體的詳細結構，研究人員將Cryo-EM和依賴於超算技術的整合分子計算建模技術結合在一起，捕獲三種不同功能狀態下的人PIC結構：1）與啟動子區域的DNA雙螺旋接觸時的 關閉狀態；2）與轉錄泡接觸時的打開狀態，3）準備執行mRNA合成的起始轉錄狀態。他們也能夠可視化觀察人PIC複合體中多種之前並未確定的組分。這些發現揭示出轉錄因子TFIIH的完整亞 基組裝結構，其中TFIIH在打開啟動子區域中發揮著至關重要的作用。TFIIH是PIC複合體中結構最難解析的組分之一。

3.EMBO Reports：線粒體研究獲重大突破！科學家有望攻克癌症等多種疾病！

doi:10.15252/embr.201744261

近日，一項刊登在國際雜誌EMBO Reports上的研究報告中，來自英國埃克塞特大學的研究人員通過研究深入闡明了線粒體是如何被製造的？線粒體作為人類細胞的能量工廠，其有著自身的DNA，並且需要多種不同的蛋白質來維持功能，但至今研究人員並未清楚闡明線粒體的形成及其發揮功能的相近分子機制。

研究者Vicki Gold博士表示，細胞中有些核糖體能夠同線粒體吸附，這或許就能夠解釋在被製造的同時蛋白質是如何被「推向」線粒體的，相關研究或為研究人員深入研究蛋白質靶向作用及線粒體功能異常提供新的線索，線粒體功能異常往往與多種疾病發生有著直接的關係，比如癌症和神經變性疾病（帕金森疾病）等。蛋白質對於幾乎所有的細胞過程都非常重要，而且細胞不得不製造大量多種蛋白質並且將其精準化運輸到目的地來維持機體的功能。

以線粒體為例，蛋白質必須穿越兩個膜的邊界才能夠進入線粒體內部，這項研究中，研究人員通過深入研究清晰地揭示了核糖體是如何與線粒體進行吸附的，研究者利用低溫電子顯微檢查技術對健康細胞中的吸附過程進行了圖像捕捉和拍攝，下一步研究者計劃在非健康的細胞中闡明這種吸附過程發生的機制。

4.PNAS：解析出P22病毒的詳細化學結構

doi:10.1073/pnas.1621152114

噬菌體P22的完整衣殼結構圖，圖片來自C.Hryc/the Chiu Lab。

在一項新的研究中，來自美國貝勒醫學院、勞倫斯伯克利國家實驗室、麻省理工學院和普渡大學的研究人員史無前例地解析出P22病毒的近原子解析度的化學結構。相關研究結果於2017年3月6日在線發表在PNAS期刊上，論文標題為「Accurate model annotation of a near-atomic resolution cryo-EM map」。論文通信作者為貝勒醫學院生物化學與分子生物學教授Wah Chiu博士。

論文共同第一作者、Chiu實驗室研究生Corey Hryc說，「在2011年，我們已發布了P22病毒的結構，從而允許我們確定性地描繪出絕大多數蛋白質骨架結構，但是我們不能夠可視化觀察它的詳細細節，比如單個小的側鏈。從那以後，顯微技術不斷在改進；我們有新的檢測器，這些檢測器允許我們記錄更好的更高對比度的結構圖片，從而允許我們改進我們的數據的解析度。此外，我們有新的處理演算法，從而允許我們增加我們解析這種結構的能力。」

Chiu說，「這項研究的新穎之處在於我們利用低溫電子顯微技術獲得2萬多張P22病毒的二維結構圖片，然後利用計算程序將它們結合在一起，產生史無前例詳細的三維結構圖片。」

對P22病毒的高解析度三維圖片進行分析允許這些研究人員極詳細地觀察這種病毒中的蛋白的所有構成單元（即氨基酸），包括它們的側鏈和它們如何與附近的氨基酸相互作用。

5.Nature：重磅！首次解析出細胞核骨架的三維分子結構

doi:10.1038/nature21382

在一項新的研究中，來自瑞士、美國和以色列的研究人員利用三維電子顯微技術首次成功地在分子解析度上闡明細胞核的核纖層（lamina）結構。這個核骨架（即核纖層）讓高等真核生物中的細胞核保持穩定，並且參與遺傳物質組裝、激活和複製。肌肉萎縮症和過早衰老等疾病是由編碼核纖層蛋白（lamin）的基因發生突變導致的。如今，人們能夠更加高效地研究這些疾病。核纖層蛋白是核纖層的主要組分。相關研究結果於2017年3月1日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「The molecular architecture of lamins in somatic cells」。

與細菌相比，在真核生物中，遺傳物質位於細胞核中。細胞核的外層是由核膜組成的。核膜含有很多核孔。分子通過這些核孔進出細胞核。在核膜下方是核纖層。核纖層是細長的網路結構，僅幾納米厚。它讓細胞核保持穩定，並且讓細胞核中的DNA免受外面的影響。再者，核纖層在細胞核內發生的至關重要的過程（如染色體組裝，基因激活，以及細胞分裂之前的遺傳物質複製）中起著關鍵性的作用。

如今，在瑞士蘇黎世大學生物化學系細胞生物學教授Ohad Medalia的領導下，一個研究團隊首次成功地詳細闡明哺乳動物細胞中的核纖層的分子結構。他們利用低溫電子斷層掃描術研究了小鼠的成纖維細胞。論文第一作者Yagmur Turgay解釋道，「這種技術將電子顯微術和斷層掃描術結合在一起，能夠在准自然狀態下可視化三維觀察細胞結構。」這些細胞在零下190度下凍存在液態乙烷中而無需事先接受有害化學物的處理，因而將細胞結構保持在它們的原始狀態。

Yagmur Turgay在描述這種核骨架的結構時，說道，「這種核纖層蛋白網路結構大約14納米厚，直接位於核膜的核孔複合物下方，由或多或少密集堆積的區域組成。」這種核骨架是由薄薄的具有不同長度的細長結構（即核纖層蛋白絲）組成的。這些核纖層蛋白絲僅3.5納米厚，要比形成位於高等生物中的細胞核外面的細胞骨架的那些結構更薄和更加脆弱。

6.Nature子刊：突破！科學家或有望開發出治療多種人類疾病的新型藥物靶向療法

doi:10.1038/nsmb.3444

近日，一項刊登在國際雜誌Nature Structural and Molecular Biology上的研究報告中，來自昆士蘭大學的研究人員通過研究在分子水平上對免疫系統進行了深入地理解，相關研究或為開發治療一系列疾病的新型療法提供新的思路。

這項研究或為科學家們開發治療多種疾病和感染的新型療法奠定了一定基礎，研究者Bostjan Kobe說道，本文研究中我們首次發現，toll樣受體蛋白下游信號的發生或許在機體先天性免疫系統中扮演著關鍵角色，這些受體蛋白或許是一把雙刃劍，從一方面來講，其能夠幫助機體抵禦感染，同時其還負責針對一系列疾病產生病理性的炎性反應，比如慢性炎性疾病、自身免疫疾病、心血管疾病和癌症相關的疾病和感染相關癥狀等。

研究者認為，相關的信號通路或許能幫助他們開發治療一系列疾病的新型藥物；Kobe表示，信號組裝結構或許能夠為我們提供新的方法，利用理性的基於結構的方法來設計新型治療性藥物。這或許同之前澳大利亞研究人員開發出的吸入式流感藥劑瑞樂沙(Relenza)類似，近些年來，研究人員發現了先天性的免疫受體，尤其是toll樣受體。

隨後Kobe說道，信號機制問題目前依然比較有爭議，在過去15年里很多研究者提出了一些不正確的分子模型，但這些模型所依賴的數據卻極為有限；因此我們設法對這些信號進行重新組裝，利用低溫電鏡來確定其結構，同時提出決定性的證據來解釋細胞中的信號機制。

7.Science：解析出酵母線粒體核糖體的結構

doi:10.1126/science.aal2415

線粒體是產生ATP的真核生物細胞器。它們有專用的核糖體，即線粒體核糖體（mitoribosome）。線粒體核糖體編碼一些在ATP產生中不可或缺的膜蛋白。Nirupa Desai等人利用低溫電子顯微術解析出這種75組分酵母線粒體核糖體的高解析度結構。線粒體核糖體與現代的細菌核糖體具有共同的祖先。酵母線粒體核糖體和哺乳動物線粒體核糖體的結構之間的比較結果提示著它們如何發生不同的進化，從而執行物種特異性的功能。

8.Science：科學家成功解析HIV病毒關鍵結構 攻克重大難題

doi:10.1126/science.aah5163

美國Salk研究所的科學家們最近解析了HIV 病毒中一個關鍵部分的原子結構，這個叫做整合體（intasome）的關鍵結構能夠幫助HIV整合到人類宿主DNA並在體內複製。相關研究結果發表在國際學術期刊Science上，該研究有助於開發新的HIV治療藥物。

本文作者Dmitry Lyumkis表示：「HIV是一種非常聰明的病毒，學會了如何逃脫最好的藥物。深入理解病毒逃逸機制，開發適用性更強的藥物將會是未來研究的一個主要方向。」

在這項新研究中，研究人員使用了單顆粒低溫電子顯微鏡，這種技術能夠幫助科學家們對比較大的複雜動態分子進行圖像捕捉。他們在病毒整合體上添加了一個特殊蛋白促進整合體在甘油中的溶解性，並加入了一些鹽離子防止蛋白聚集成塊。

9.Science：首次證實蛋白合成與mRNA降解在結構上存在關聯

doi:10.1126/science.aaf7520

蛋白合成是由信使RNA（mRNA）編碼的，而且當足夠多地產生一種給定的蛋白時，編碼它的mRNA會被降解。如今，在一項新的研究中，來自德國慕尼黑大學的研究人員證實蛋白合成和mRNA降解在結構上存在關聯。相關研究結果近期發表在Science期刊上，論文標題為「The cryo-EM structure of a ribosome–Ski2-Ski3-Ski8 helicase complex」。

在所有細胞中，儲存在DNA分子中的遺傳信息編碼用於蛋白合成的指令。這種遺傳信息首先經轉錄產生mRNA，隨後mRNA對被稱作核糖體的分子機器進行編程，讓這種分子機器將這些指令「翻譯」為事先確定的氨基酸序列，即具有特定功能的蛋白。當一個mRNA分子不再需要或被識別為存在缺陷時，它被轉運到一種被稱作外切體（exosome）的蛋白複合體中。這種細胞器作為一種分子碎片機發揮作用，將mRNA切成它們的組成單元，而且這種切割是從它們的3』端開始的。如今，慕尼黑大學結構生物學家Roland Beckmann與來自德國馬克斯普朗克生物化學研究所和法國巴斯德研究所的研究人員一起證實核糖體與降解mRNA的外切體存在直接的分子關聯性。

一組被稱作Ski複合體的蛋白在降解mRNA中發揮著至關重要的作用。這種複合體將這些mRNA分子轉運到外切體中，而且通過這樣做，這些mRNA分子解摺疊它們自己的複雜的空間構象，從而使得它們遭受酶降解成為可能。Beckmann說，「利用低溫電子顯微鏡成像技術，我們如今首次證實核糖體在結構上與Ski複合體相互作用，這主要是因為我們成功地分離出和可視化觀察這種相互作用中關鍵性的中間物。」

10.Science：首次發現病毒操縱細菌細胞結構機制

doi:10.1126/science.aal2130

在一項新的研究中，來自美國加州大學聖地亞哥分校的研究人員首次描述非常大的病毒在感染期間如何重編程細菌細胞內的結構。這一重編程過程讓這些外來入侵的病毒誘導細胞產生上百個新的病毒，最終讓它們感染的細胞因發生爆裂而死亡。相關研究結果發表在2017年1月13日那期Science期刊上，論文標題為「Assembly of a nucleus-like structure during viral replication in bacteria」。

細菌缺乏很多在植物細胞或動物細胞中讓細胞過程區室化的特殊結構。比如，細菌缺乏一種膜包圍的細胞核。細胞核含有遺傳信息，起著細胞控制中心的作用。不過，Pogliano實驗室博士後研究員Vorrapon Chaikeeratisak和研究生Katrina Nguyen發現入侵的噬菌體讓細菌內部發生結構重組，從而產生類似於在真核細胞中發現的那些結構。利用熒光顯微鏡，Chaikeeratisak和Nguyen發現當噬菌體在細菌細胞內複製時，它們構建區室從而將感染期間發生的不同過程分隔開來。

加州大學聖地亞哥分校化學與生物化學教授Elizabeth Villa和加州大學舊金山分校生物化學與生物物理學教授David Agard採用一種被稱作低溫電子斷層掃描術（cryo-electron tomography, cryo-ET）的技術捕捉Chaikeeratisak和Nguyen起初在非常高的放大倍數下發現的那些過程的圖像。

這些圖像表明新的噬菌體顆粒在細菌的細胞核樣區室（nucleus-like compartment）周圍進行組裝。最終，這些新的病毒顆粒讓細胞發生爆裂並擴散出去，從而感染附近的細胞。

11.Nature子刊：突破！科學家首次闡明未成熟寨卡病毒的精細結構

doi:10.1038/nsmb.3352

最近，一項刊登在國際雜誌Nature Structural & Molecular Biology上的研究報告中，來自普渡大學的研究人員通過研究鑒別出了未成熟寨卡病毒的高解析度結構，這為後期科學家們深入闡明寨卡病毒感染宿主細胞以及擴散的分子機制提供了新的思路。

去年研究人員通過研究確定了成熟寨卡病毒的結構，對病毒結構的深入研究或許就能夠幫助科學家們開發出新型有效的抗病毒療法和疫苗。文章中研究者利用了一種名為低溫電子顯微檢查技術在9？的解析度下觀察未成熟寨卡病毒的結構，研究者發現，病毒的基因組位於一種保護性外膜中，外膜包含了一種脂質膜、包膜蛋白、前體膜蛋白和衣殼蛋白；同時研究者還深入研究了不成熟病毒衣殼蛋白的位置，衣殼蛋白能夠幫助研究人員識別病毒的遺傳物質，同時其還能夠作為一種伴侶分子來引導RNA鏈進入到病毒中進行組裝。包膜蛋白對於病毒的結合、吸附以及同宿主細胞融合非常關鍵，同時膜蛋白還能夠幫助成熟病毒分裂來使其從宿主細胞中釋放出去。

對未成熟病毒結構進行研究能夠幫助研究者闡明多種蛋白的精細結構，研究者指出，病毒的包膜蛋白和前體膜蛋白在病毒表面能夠排列成為60個刺狀樣結構，衣殼蛋白就會位於脂質膜的內側，這種結構不同於成熟寨卡病毒，成熟病毒中的膜蛋白能夠被包膜蛋白所覆蓋，相關研究結果同時還闡明了不成熟寨卡病毒和其它不成熟黃病毒之間的結構差異，值得注意的是，在其它不成熟的黃病毒中部分有序的衣殼蛋白殼似乎就沒有那麼重要了。

12.Nat Protocols：利用低溫光學和電子顯微鏡聯合技術觀察並研究活體病毒

doi:10.1038/nprot.2016.168

光鏡和電鏡研究領域的巨大進步目前正在改善科學家們對多種病毒可視化研究的能力，比如HIV、呼吸道合胞體病毒、麻疹病毒、流感病毒以及寨卡病毒等，近日，一項刊登在國際雜誌Nature Protocols上的研究報告中，來自埃默里大學醫學院等研究機構的研究人員通過研究開發出了一種新型的低溫相關的光鏡和電鏡工作流（工作站，cryo-CLEM）。

此前研究中，研究者對純化的病毒進行研究能夠獲取多種已知病毒電子顯微鏡圖像，然而病毒純化的過程常常會使得包膜病毒的結構發生改變，因此研究者Wright及同事就對當前技術進行了改善來研究病毒的結構特性，因此如今研究者就能夠清楚觀察到病毒進入細胞並在細胞中組裝的信息了。研究者表示，我們非常想知道某些病毒如何在細胞中複製，如今我們在光鏡和電鏡之間建立了一種「橋樑」，我們希望通過這種聯合技術能夠更加清楚地觀察病毒的作用機制。

文章中，研究者首先在脆性碳覆蓋的黃金網格中對病毒感染或轉染的細胞進行培養，隨後進行玻璃化操作，即對細胞快速冷卻以免冰晶形成，一旦細胞被冷卻研究人員就能夠利用低溫熒光顯微鏡和低溫電子斷層掃描術對細胞進行研究，低溫（負150度以下）對於這兩種技術而言非常必要，而且樣品玻璃化後進行光學顯微鏡檢查還能夠抑制細胞繼續生長以及位置發生改變。

研究者指出，利用低溫電子斷層掃描術獲得的數據還能夠幫助我們在高解析度下獲取單一完整病毒和病毒蛋白的圖像，這項研究中研究者對呼吸道合胞體病毒進行了研究，他們發現，候選減毒活疫苗在結構上同呼吸道合胞體病毒結構非常相似。這種名為cryo-CLEM的新技術能夠對扁平生長的細胞進行研究，因為標準的光束並不能夠穿透厚度大於1微米的細胞，而哺乳動物的細胞通常有幾微米寬，而諸如HIV等病毒大約為0.1微米。

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