清華大學李雪明研究組揭示細菌II型分泌系統外膜複合物的分泌機制

2017年1月9日，清華大學生命科學學院李雪明課題組在《Nature Structural & Molecular Biology》雜誌在線發表題為《細菌II型分泌系統的分泌素結構及其工作機制》（Structural Insights into Secretin Translocation Channel in Type II Secretion System）的研究論文，該工作通過冷凍電鏡的研究手段首次揭示了細菌II型分泌系統外膜複合物GspD分泌素通道的原子解析度結構以及通道的半開放狀態結構，結合相應的生化實驗，闡述了底物通過II型分泌系統分泌素的分泌機理。

革蘭氏陰性菌通過一系列不同類型的分泌系統向胞外或者其他細胞分泌各種底物，包括離子，小分子（如抗生素），大分子物質（如毒性蛋白，DNA）等，這些分泌出的底物大多都與人類健康息息相關。其中的II型分泌系統（T2SS）分泌的底物主要是摺疊好的成熟蛋白質，通常是與疾病直接相關的毒性因子或效應蛋白，其中比較熟知的有霍亂毒素、腸毒素，以及外毒素A。T2SS的外膜複合物分泌素GspD是分泌底物通過細菌外膜的最後通道，先前只有N末端幾個結構域的晶體結構，以及低分辨冷凍電鏡結構。長久以來，缺乏高解析度的結構信息來幫助理解通道的整體構造及相應的底物分泌機理。

該工作通過冷凍電鏡單顆粒重構的方法首次解析了全長分泌素GspD複合物約3 ?解析度的分子結構，包括Escherichia coli 來源的和Vibrio cholerae來源的兩種複合物。這不僅是T2SS外膜複合物第一個全長的原子解析度結構，也是分泌素家族的第一個全長的原子解析度結構。該工作首次揭示了GspD複合物具有十五重對稱性（C15），不同於之前報道的十二重對稱(C12)結構模型。該分子結構清晰地展示了蛋白N端結構域形成的環形通道結構，澄清了之前通過晶體結構推測出來的不準確結構模型。該工作還首次觀察到了一個由C端結構域形成的新穎的雙層β桶構造，其中每層至少有60根反平行的β-strands構成，是目前結構已知的最大β桶構造的通道。這一巨大的桶形結構由外表面上結合的S結構手把手圍繞起來，發揮穩定雙層β桶的作用。通過在中心通道的邊緣區域點突變的方法將非常保守的甘氨酸突變成丙氨酸，使關閉的分泌素通道轉變成到一個半開放的狀態，通過進一步的結構和功能分析，本工作闡述了底物通過分泌素GspD通道的分泌機理。

分泌素GspD蛋白的冷凍電鏡結構和通道開關的分子機制

（a）GspD複合物的電子密度圖和原子模型圖。上半部分為Escherichia coli 來源的GspD，下半部分為Vibrio cholerae來源的GspD，右半部分為電子密度圖和原子模型疊加在一起的頂視圖。（b）半開放狀態的結構與野生型的對比剖面圖。電子密度圖低通濾波到7?。（c）基於得到的結構和生化驗證提出的通道開放分子模型圖。黑色圓圈表示中間門控起轉折的關鍵甘氨酸。

清華大學生命學院李雪明研究員和浙江大學的朱永群教授為本工作的共同通訊作者。清華大學生命學院三年級直博生嚴照峰和PTN項目三年級博士生尹孟為本文共同第一作者。浙江大學博士生徐丹丹也參與了這項研究工作。該工作的冷凍電鏡數據採集在國家蛋白質科學設施（北京）的清華大學冷凍電鏡平台完成，數據處理在國家蛋白質科學設施（北京）清華大學高性能計算平台完成。該工作獲得了生命科學聯合中心、北京市結構生物學高精尖創新中心、國家自然科學基金委面上項目和科技部重點研發計劃的經費支持。

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