2016年12月CRISPR/Cas重大進展梳理

2016年12月31日/生物谷BIOON/--基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短迴文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。

接下來，小編列舉最近一段時間CRISPR基因編輯系統取得的重大進展，詳情如下所示。

1.Nature：重磅！發現兩種新的CRISPR系統

doi:10.1038/nature21059

在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校的研究人員在之前未被探究過的很難在實驗室里培養的細菌中發現簡單的類似於CRISPR-Cas9---一種已引發生物學變革的基因編輯工具---的 CRISPR系統。

這些新的CRISPR系統是高度緊湊的，適合於在地球上的一些最小的生物體內存在。如果這些系統也能夠像CRISPR-Cas9那樣接受改造，那麼它們較小的尺寸使得它們更容易插入到細胞中進行 DNA編輯，從而擴大科學家們和醫生們能夠獲得的基因編輯工具箱。

在這些新的CRISPR蛋白中，一種被稱作CasY的蛋白是在一群龐大的最近被認識到的細菌--- Banfield將之稱為候選門輻射群（candidate phyla radiation, CPR），可能含有一半的細菌多樣 性，生活在間歇噴泉和地下幾英尺的土壤中---中發現的。另一種新的蛋白被稱作CasX，是在來自已知的生活在地下水和沉積物中的細菌門的細菌中發現的。

研究人員隨後在大腸桿菌中重建CasX和CasY系統，並且發現這些系統讓這種細菌---正常情形下不含有一種有活性的CRISPR系統---阻止外源DNA轉化。Doudna和她的同事們正在研究這兩種系統 在生化上如何工作，以便希望構建出一種可作為CRISPR-Cas9補充的基因編輯工具。

2.Cell：首次發現CRISPR/Cas9基因編輯的「關閉開關」

doi:10.1016/j.cell.2016.11.017

CRISPR/Cas9基因組編輯正快速地引發生物醫學研究變革，但是這種新技術迄今為止並不是非常精確的。這種技術能夠在基因組中無意地產生過多的或者不想要的變化，產生脫靶突變，從而限 制了它在治療應用中的安全性和療效。

如今，在一項新的研究中，來自美國馬薩諸塞大學醫學院和加拿大多倫多大學的研究人員發現首批已知的CRISPR/Cas9活性「關閉開關」，從而為CRISPR/Cas9編輯提供更好的控制。

馬薩諸塞大學醫學院RNA治療研究所教授Erik J. Sontheimer博士、多倫多大學分子遺傳學教授Alan Davidson博士和多倫多大學生物化學助理教授Karen Maxwell博士鑒定出三種自然產生的抑 制Cas9核酸酶的蛋白。這些被稱作抗CRISPR的蛋白具有阻斷Cas9切割DNA的能力。

3.Cell：贊！又發現兩種新的抗CRISPR蛋白

doi:10.1016/j.cell.2016.12.009

在剛剛發現幾種能夠阻斷人細胞中的CRISPR-Cas9活性的蛋白（Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.11.017）之後，來自美國加州大學舊金山分校的Joseph Bondy-Denomy和同事們在一項新的研 究中報道了更多的抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）。

研究人員先假設細菌基因組可能含有一種抑制劑來阻止CRISPR切割其自身基因組中的靶標，然後通過在細菌基因組中尋找CRISPR序列和它的靶標而發現這些Cas9抑制劑。確實，Rauch和同事們 揭示出幾種存在於李斯特菌中的抗CRISPR蛋白，而且這些抗CRISPR蛋白的序列是之前的噬菌體感染中遺留在李斯特菌基因組中的。Rauch說，「正如CRISPR技術是基於細菌的天然抗病毒防禦系 統開發出來的，我們也能夠利用病毒製造出的抗CRISPR蛋白來繞過這些細菌防禦系統。」

這項研究發現兩種蛋白抑制劑AcrIIA2和AcrIIA4阻斷來自釀膿鏈球菌的Cas9酶活性，其中Cas9是一種經常用於基因組編輯中的DNA切割酶。

4.CRISPR之父張鋒2017年開年綜述

doi:10.1002/bies.201600186

近期Broad研究員的CRISPR技術先鋒張鋒，與美國國立健康研究院Eugene V. Koonin研究員合作發表了一篇綜述：Coupling immunity and programmed cell suicide in prokaryotes： Life-or-death choices。在文中他們指出，CRISPR-Cas的盛行主要是因為其在基因組編輯與調控中可以作為新一代的研究工具，但是CRISPR-Cas系統本身也令人著迷，尤其是作為一種獨特的 免疫系統機制，可以說，CRISPR-Cas功能中最絢爛的部分就是它是唯一一種已知的，攜帶可遺傳基因組記憶的獲得性免疫系統，即拉馬克理論中獲得性性狀遺傳機制。

同時CRISPR-Cas系統的發現也刺激了原核生物防禦系統的研究，在這個過程中，免疫力與程序性死亡之間千絲萬縷的關係變得更為明確了，從而這兩種防禦系統之間的功能偶聯關係理論也逐 漸形成。這篇綜述就主要探討了這兩者之間的關聯，並從目前的研究發現出發，介紹了一些防禦系統，免疫力與程序性死亡的有限融合。

目前CRISPR-Cas系統可分為兩個不同的種類，每種包含三大類型和多個亞型。結合生物化學與分子遺傳學大大推動了揭示不同CRISPR-Cas類型許多獨特的特徵。此外，結構分析和單分子研究 進一步增進了我們對CRISPR-Cas功能分子基礎的認識。但是我們對CRISPR-Cas系統的認識還有許多問題有待揭示，比如對於近期發現並確定了新CRISPR-Cas類型的特徵表明，以我們當前的知 識來預測親緣關係遙遠的CRISPR-Cas變體的功能細節能力還相對有限。因此，需要徹底地剖析新發現的CRISPR-Cas系統認識它們的生物學作用，揭示它們的分子機制，利用它們的潛能來開發 生物技術。

5.CRISPR女神Jennifer再發重量級Reviews：CRISPR-Cas系統引領藥物發現途徑和疾病治療方案的革新

doi:10.1038/nrd.2016.238

CRISPR-Cas系統作為基因組編輯和調節的編程工具，可以在各種細胞中（包括人類細胞）進行遺傳操作。雖然目前科學家們的注意力主要集中在CRISPR-Cas系統治療孟德爾遺傳疾病方面的潛 力，但是該技術還有望為複雜的體細胞疾病提供新的治療方法，同時CRISPR-Cas通過加速藥物靶點的鑒定和驗證，成為下一代藥物研發的有利工具。

近日CRISPR先驅——「女神」Jennifer在nature再發新成果，她的研究小組發現了兩個CRISPR新系統，十分振奮人心。由此可見CRISPR自問世以來總是帶給人們驚喜不斷，可謂引發了遺傳學 等生物學科研究和醫藥領域的革命。12月23日《Nature Reviews Drug Discovery》在線發表的文章，Jennifer也參與其中，此次她們將目光投向CRISPR-Cas系統帶來的藥物發現途徑和疾病治 療方案的革新。

CRISPR-Cas編輯可以加速功能基因組學發展，揭示細胞機制並確證新的藥物靶點，開發更好的用安全性測試的模型，以及改善治療方案等。快速基因編輯也可以生成定製的自體細胞治療，包 括癌症治療的T細胞和重新編程的ipsC，應用於非遺傳性疾病創新療法。雖然CRISPR-Cas系統將進一步改進，但我們相信基因編輯已開始對全世界的藥物發現和開發產生直接的影響。

6.中科院生物物理研究所王艷麗課題組在Crispr/Cas系統獲得新的研究成果

doi:10.1016/j.molcel.2016.11.040

2016年12月15日，Molecular Cell 雜誌在線發表了中科院生物物理研究所王艷麗課題組關於CRISPR-Cas系統的最新研究成果，文章標題為「C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA- Guided DNA Cleavage Mechanism」。

在本研究中，課題組成員解析了結合有sgRNA的C2c1晶體結構。該結構顯示C2c1由兩個區域構成，分別是具有識別sgRNA功能的REC區域和具有核酸酶功能的NUC區域。sgRNA是由crRNA和 tracrRNA人工嵌合而成，其中，crRNA結合在C2c1的中心孔道內，tracrRNA則被安置在C2c1外表面的凹槽中。有趣的是，通過進一步觀察，課題組研究人員發現C2c1對應的sgRNA呈現出一種與 Cas9對應的sgRNA或最近報道過的Cpf1所對應的crRNA顯著不同的結構。受到這個新結構的提示，研究人員一方面分析了其他物種的C2c1所對應的sgRNA結構，另一方面縮短了該sgRNA的長度， 並進行活性實驗，這兩方面的結果都初步驗證了這種獨特結構的真實性和有效性。此外，該研究還發現目的序列的單個鹼基突變可以顯著降低C2c1剪切活性，這表明C2c1對靶定的目的序列有 極其嚴格的要求，這一研究結果有助於開發新的基因組編輯工具，降低基因編輯過程中的脫靶現象。

7.Nat Genet：利用CRISPR鑒定出潛在的HIV治療靶標

doi:10.1038/ng.3741

在一項新的研究中，來自美國懷特海德研究所、拉根研究所和布羅德研究所的研究人員利用CRISPR-Cas9基因編輯技術鑒定出三個有望用於治療HIV感染的新靶標。他們描述了如何利用CRISPR 篩選HIV感染但不是細胞存活所必需的人基因的方法鑒定出5個基因---它們的三個在早前的利用RNA干擾（RNAi）的研究中並未被鑒定出。他們的方法也能夠被用來鑒定出針對其他的病毒性病 原體的治療性靶標。

利用CRISPR對源自HIV敏感性的CD4陽性T細胞的一種細胞系進行篩選，研究人員鑒定出5個基因：當讓它們失活時，會讓細胞免受HIV感染，同時不會影響細胞存活。除了CD4和CCR5之外，這種 篩選方法鑒定出編碼兩種酶的基因---TPST2和SLC35B2：它們對CCR5進行修飾以便HIV結合。另一個被鑒定出的基因是ALCAM，它參與細胞間粘附。當CD4陽性T細胞接觸低水平HIV病毒時，正如 在自然傳播中可能觀察到的那樣，ALCAM缺失與顯著地抵抗HIV感染相關聯。

8.Science：重磅！利用CRISPRi鑒定出細胞生長所需的499個lncRNA

doi:10.1126/science.aah7111

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類神秘的長200多個核苷酸但不會編碼任何蛋白的分子。如今，在一項新的研究中，研究人員鑒定出499個lncRNA是功能性的，並且在理解這些分子如何發揮作用 方面取得重大進展。他們報道，不同於大多數蛋白編碼基因---它們往往是眾多細胞系所必需的---的是，針對測試的6種細胞系，在鑒定出的lncRNA中，將近90%的lncRNA似乎影響僅僅其中的 一種細胞系的強勁生長。

Lim、Weissman和同事們開發出一種CRISPR干擾（CRISPR interference, CRISPRi）平台，這種平台靶向7種不同的細胞系---6種轉化的細胞系和一種人誘導性多能幹細胞---中的16,401個 lncRNA位點。通過利用他們的這種經過修飾的CRISPR技術抑制每個候選lncRNA的表達從而對上千個位點進行篩選之後，他們鑒定出499個lncRNA位點是強勁的細胞生長所需要的，其中89%的位 點似乎僅在一種細胞類型中發揮功能。

Rinn說，「這項研究是首次在特定的細胞系中對lncRNA進行全基因組篩選。依據這項研究，我們如今能夠作出結論：大多數lncRNA在細胞活力中發揮著重要作用，正如猜測中的那樣。但是如 今，可以這麼說，一切還得實踐證明。」

9.Nat Methods：開發出自我編輯的CRISPR條形碼

doi:10.1038/nmeth.4108

通過調整CRISPR-Cas9基因編輯複合體，使得它在自己的嚮導RNA（gRNA）位點上發生突變，研究人員開發出一種方法讓細胞持續地產生它們自己獨特的條形碼。根據上周（12月5日）發表在 Nature Methods期刊上的一篇論文，這種技術是由美國麻省理工學院和哈佛大學的兩個研究團隊獨立開發的，已在哺乳動物細胞中用於分子記錄---正如今年夏天（8月18日）在Science期刊（ doi:10.1126/science.aag0511）上描述的那樣---和用於譜系追蹤。

當利用CRISPR-Cas9系統在真核細胞中產生突變時，可能存在的突變數量受到gRNA本身的限制。在靶DNA元件發生一些突變後，gRNA不再具有足夠的序列同源性，因而不能夠有效地引導Cas9。

為了增加CRISPR-Cas9系統的信息儲存能力，兩個研究團隊---一個團隊由麻省理工學院科學家Tim Lu領導，另一個團隊由哈佛大學科學家George Church領導---想出同一種解決方法：讓gRNA 位點含有一種PAM序列以便能夠自我編輯。

Lu團隊利用它的「自我靶向」CRISPR系統構建出記錄炎症的細胞：這些細胞在對小鼠體內的炎性信號作出反應時，會啟動gRNA位點發生自我引導的突變。與此同時，Church團隊利用它的「自 導（homing）」系統追蹤體外培養的細胞譜系。

Church實驗室研究員Reza Kalhor說，這種自導gRNA系統「在它的位點上產生的多樣性是常規的gRNA在它的靶標上的8到10倍。」然而，這種記錄能力並不是無止境的。他解釋道，「[CRISPR產 生的]大量突變往往是缺失突變」，因此在一系列突變後，這種匹配的RNA序列---開始時僅20個核苷酸左右---變得太短而不能發揮功能。Kalhor說，「它基本上是搬起石頭砸自己的腳。」

10.Cell：將CRISPR和單細胞RNA測序結合在一起分析基因功能

doi:10.1016/j.cell.2016.11.039

哪些突變組合有助癌細胞存活？大腦中哪些細胞參與阿爾茨海默病發生？免疫細胞如何執行它們的複雜決策過程？如今，在一項新的研究中，來自以色列魏茲曼科學研究所等機構的研究人員 在一種方法中將兩種強大的研究工具--- CRISPR基因編輯和單細胞基因組分析---結合在一起，從而可能最終有助我們解答這些問題和更多的其他問題。

將CRISPR與高解析度的單細胞RNA測序結合在一起能夠讓研究人員主動地調整細胞中的基因，然後理解它們在多種條件下在多種細胞中的功能。Amit和他的團隊（包括論文第一作者Diego Adhemar Jaitin、Ido Yofe和Assaf Weiner，研究生David Lara-Astiaso）面臨的挑戰是改編CRISPR基因編輯技術以便它能夠與單細胞測序結合在一起使用。Amit團隊想像著一次靶向多種基 因，包括靶向同一個細胞中的多個靶標，然後鑒定出給細胞帶來的變化和這些基因的功能。一方面，這項任務需要開發新的分子技術以便同時鑒定出靶細胞和引入到它們當中的基因組編輯。 另一方面，這項任務需要開發新的計算方法來分析具有不同基因型和表型的細胞群體。

研究人員隨後遇到一種新的數據類型---伴隨著一些遺失的數值。Weiner說，「通過將細胞與類似的行為關聯在一起，Netflix演算法等被用來將喜歡類似電影的人們進行歸類，我們能夠鑒定出 很多基因之前未被分類的功能。」

11.中國科學家研究發現腫瘤惡病質的潛在基因治療方法

doi:10.1038/mt.2016.172

12月5日，國際學術期刊Molecular Therapy發表了我所丁秋蓉研究組的最新研究成果「Prevention of Muscle Wasting by CRISPR/Cas9- mediated Disruption of Myostatin In Vivo」。該 研究針對腫瘤病人中存在的嚴重肌肉萎縮病症，提出通過CRISPR在體特異靶向敲除肌肉組織中的肌生成抑制素（myostatin）達到延緩肌肉萎縮的治療目的。

在此項研究中，研究生韋余達等在丁秋蓉研究員的指導下通過SaCRISPR/Cas9針對在惡病質中被激活進而誘導肌肉蛋白降解的myostatin信號通路，通過在體靶向敲除肌肉中的myostatin達到了 部分緩解惡病質的效果。選擇myostatin作為靶點的主要原因為：1）myostatin信號通路為肌肉生長發育的負調控因素。已發現天然攜帶myostatin功能缺失突變的自然人，除肌肉系統強壯外 ，臨床上沒有發現其他嚴重不良影響，靶向安全性有所保證；2）前期的系列小鼠和臨床試驗證明myostatin信號通路在惡病質中起關鍵作用，而針對myostatin的單抗目前正處在臨床試驗期（ 針對胰腺癌病人的惡病質治療）；3）myostatin主要由肌肉細胞分泌，主要作用方式是自分泌/旁分泌方式，因此局部肌肉微環境中的myostatin濃度降低便能在惡病質發生情形下保留部分肌 肉功能。

基於此，韋余達等利用肌肉特異啟動子啟動SaCas9（staphylococcus aureus cas9）的表達，包裝入腺相關病毒載體（AAV）後，通過定點注射小鼠腓腸肌組織靶向小鼠Mstn基因（編碼 myostatin蛋白），在腫瘤誘導的惡病質小鼠模型中觀察到骨骼肌功能的顯著恢復（相比未靶向組小鼠，平均骨骼肌重量提高9%，平均抓力提高25%，並且在注射點處切片染色發現肌纖維萎縮 得到明顯緩解）。研究作為一個驗證性實驗，提示利用基因編輯特異靶向敲除肌肉組織中的myostatin可以作為防治惡病質的一個潛在基因療法，而進一步提高體內靶向效率、全面評估靶向安 全性將有助於其真正的臨床轉化。

12.PNAS：重磅！利用分子樂高產生更優的CRISPR基因編輯工具

doi:10.1073/pnas.1616343114

在一項新的研究中，來自加拿大西安大略大學的研究人員利用分子樂高（molecular-Lego），將一種工程酶加入到革命性的新的基因編輯工具CRISPR/Cas9中。他們的研究表明在靶向基因組中 的基因中，加入這種酶會使得基因編輯更加高效和潛在地更具特異性。

研究人員證實構建一種被稱作TevCas9的酶會使得DNA修復更難再生這個切割位點，其中TevCas9是在兩個位點而不是在單個位點切割DNA。他們是通過將一種被稱作I-Tevl的酶加入到核酸酶 Cas9上而構建出TevCas9的。在基因編輯工具CRISPR/Cas9中，Cas9是一種典型的用於切割DNA的酶。

這項研究也表明加入I-Tevl有望更加特異性地靶向基因，而且更不可能在基因組上產生脫靶效應，其中脫靶效應是任何潛在治療應用的一個重大的問題。（生物谷 Bioon.com）

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