Nature：CRISPR引人深思的五大疑問！

CRISPR-Cas9 的基因組編輯技術給整個學術界和工業界帶來革命性的變化，有數以千計的實驗室在用該技術進行生物科學研究，然而關於該系統的五個基礎性問題卻依然是個謎團，引人深思。

儘管科學家Francisco Mojica不是第一個看到CRISPR現象的，但卻是發現CRISPR系統的領軍人物。1992年，當他首次觀察到這個能引起生物技術革命的微生物免疫系統時，他重新檢查了嗜鹽微生物Haloferax mediterranei的基因組序列數據並注意到了14個近乎完美的迴文結構——重複著30個鹼基序列，並由36個鹼基間隔開。然而他的研究發現在當時並沒有引起學術界的重視，他們認為這種重複序列在多年前就已經在多種生物體中發現，但是其生物功能至今都沒有解釋清楚，所以不願意耗費太多精力。

但是隨著科研的進展，現在研究者已明白這些短規則間隔序列（SSR）可作為微生物的免疫系統能消滅侵襲病毒，並將其命名為CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats）。儘管目前絕大數生物研究者利用CRISPR-Cas9系統進行基因編輯，但是Mojica和其他研究者依然被該系統的一些基礎生物學問題所困擾，比如它是如何演變的，以及如何促進微生物進化的？為何有些微生物擁有該系統，而其他微生物卻沒有？也許CRISPR系統在微生物中還發揮著其他未為人知的生物功能。最早將CRISPR/Cas系統作為基因編輯工具的分子生物學家Jennifer Doudna也認為這些有趣的基礎生物學研究仍需要進一步探索。

CRISPR技術起源自哪裡？

CRISPR系統的生物學優勢非常明顯。原核生物（細菌等）以及生活在極端環境中的不知名單細胞生物（如古細菌）非常容易面臨著入侵者外源核酸的持續攻擊。病毒的數量以10：1的比例遠超過原核生物，且據說每兩天病毒就可以殺死世界上一半的細菌。原核生物還可通過質粒來交換DNA片段，一旦交換的DNA 能「綁架」宿主菌中生長過程的關鍵分子來維持自身穩定時，則該質粒具有會使宿主菌致病的能力。

然而原核生物也進化出了一系列應對外源基因侵襲的「生化武器」。比如，限制性內切酶就是一種能在/靠近DNA特定序列位點進行切割的蛋白酶。但是這種防禦功能非常遲鈍，因為每種內切酶只能靶向特定的基因序列。而動態的CRISPR/Cas系統卻更加靈活，因為它會採取類似感染時抗體發揮長期免疫作用的具體機制，來對入侵的外源性核酸進行免疫應答和免疫記憶。

Mojica等研究者在觀察到了CRISPR系統中的迴文重複序列有時能與病毒基因組序列相匹配後，便對CRISPR/Cas的功能進行了深一步的研究。研究發現當細菌和古細菌暴露於特定的病毒或質粒時，某些特定的Cas蛋白可以一些間隔序列添加至基因組中。而後由這些間隔序列轉錄的RNA會引導其他Cas蛋白靶向任何能匹配間隔序列的外源性DNA/RNA並對其進行切割。

至於細菌和古細菌為何會擁用如此複雜的免疫系統，至今還沒有得到解答。但是目前主流理論認為CRISPR系統來自於「跳躍的基因」——轉座子（Transposon），可以從基因組的一個位置轉移到另一個位置。美國國家衛生研究院的進化生物學家Eugene Koonin和他的同事發現了一類可編碼蛋白Cas1的移動基因，Cas1能將間隔序列插入基因組中。他們認為這些「Casposons」可能就是CRISPR-Cas免疫系統的起源。目前研究者正在對這些DNA轉座子的轉移過程及追蹤機制進行深入研究，並希望以此來揭示CRISPR/Cas系統的複雜性。

CRISPR/Cas系統的免疫功能

近年來已有很多研究對Cas蛋白如何在基因組中添加間隔序列（Spacers）的分子機制進行細緻的闡明。但是病毒DNA的化學成分與宿主DNA幾乎完全一致，那麼在含有外源病毒DNA的細菌中，Cas蛋白是如何確定需要被CRISPR系統識別切割的外源DNA呢？維爾紐斯大學的生物化學家Virginijus Siksnys認為，這些酶是把雙刃劍，存在錯切的風險；如果細菌將間隔序列添加至自身DNA中，那麼就會收到自身免疫系統的自殺性攻擊。

北卡羅來納州立大學的微生物學家Rodolphe Barrangou認為，這可能是因為細菌和古細菌龐大的種群數量可以容納這些錯誤的發生，因為如果種群中的大部分個體能在病毒的攻擊下得以生存的話，那麼犧牲一部分細胞也並不會種群數量造成影響。

實際上，當病毒入侵到某種細菌群體後，通常1000萬個細菌中只有一個能獲得正確的間隔序列從而獲得相應的病毒防禦功能。洛克菲勒大學的微生物學家Luciano Marraffini認為，由於很難捕獲真正獲取得具有免疫功能的細菌個體，使得細菌獲取間隔序列的機制研究變得非常困難。

然而，已有研究報告認為含有CRISPR/Cas系統的細菌細胞可作為一種記錄裝置，對其所遇到的DNA和RNA序列進行分類記錄。這便允許研究人員實時監測細菌細胞隨著環境中化學物質的變化，其基因表達水平的變化；這對揭示間隔序列的識別方式以及提高它們與基因組融合的速度是非常有用的。

另外，研究者也對CRISPR/Cas免疫記憶的形成進行了深入研究。絕大多數擁有CRISPR/Cas系統的微生物都只含有幾十個間隔序列，有的只有一個間隔序列。然而不同的是，古細菌Sulfolobus tokodaii有1%的基因組對應著其5種CRISPR/Cas系統，並包含了485個間隔序列。

通常，細菌並不會保留一些被廢棄的間隔序列：如果病毒變異後能從CRISPR/Cas免疫系統逃逸，那麼之前針對該病毒的間隔序列就會被廢棄，進而變成為細菌中冗餘的DNA片段。威茨曼科學研究所的遺傳學家Rotem Sorek認為細菌不可能會使其基因組永久的處於擴張狀態。

CRISPR系統的其他功能

目前，已知CRISPR系統中有不超過3%的間隔序列在現有的已知的DNA資料庫均找不到相應的匹配序列。這也反映出我們對病毒知之甚少，因為大多數測序工作主要集中在感染的人類、牲畜和農作物。喬治亞大學的RNA生物學家Michael Terns就認為目前我們對細菌的敵人，尤其是古生菌的敵人，所掌握的知識還非常淺薄。

至於這些不匹配任何序列的間隔序列，研究者認為可能是CRISPR/Cas系統行使除了防禦病毒侵染外其他生物功能的關鍵所在。這些序列在一些細菌中可進行DNA修復，基因表達和生物膜的形成；同時它們還可確定細菌感染他人的能力，比如引起軍團病（一種大葉性肺炎）的嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila）就只能在Cas2蛋白存在時，感染宿主變形蟲。麻州大學醫學院的分子生物學家Erik Sontheimer認為，CRISPR的其他功能還有待挖掘，也許這是與RNAi相平行的系統，因為RNAi在早期也主要被認為一種防禦機制，隨後也證實了RNAi具有調節宿主基因表達的作用。

為何不是所有微生物都擁有CRISPR系統？

儘管CRISPR/Cas系統還具有其他生物學功能，顯然一些特殊的微生物體內存在著相比於其他微生物更大量的CRISPR/Cas序列和蛋白。目前，超過90%的古細菌擁有CRISPR免疫系統，而只有1/3已測序的細菌存在該系統。古細菌Nanoarchaeum equitans寄身在另一種沸水古生菌中，其遺失了很多與細胞能量產生基因和管家基因。然而在其本身極微小的DNA（490000-letter）中，N.equitans卻擁有一個約30個間隔序列的CRISPR/Cas系統。分子生物學家Malcolm White認為，該古生菌的將大量基因組序列應用於CRISPR系統，這也說明了CRISPR系統非常重要，也許是病毒防禦或其他作用，但是目前我們對其原因還並不知曉。

微生物學家Edze Westra認為對於生活在適宜環境中的細菌而言，這種系統出現的頻率也不同。舉個例子，鳥類病原體Mycoplasma gallisepticum在其感染宿主由雞類轉為野生雀鳥時，其CRISPR/Cas系統將被拋棄。一些數學模型和早期實驗表明，在處理少數幾種病毒時，CRISPR系統更具有優勢。因為該系統可記錄有限數量的病毒基因序列來避免所添加的DNA序列成為冗餘的基因序列。但一旦環境中病毒的多樣性大大超過了CRISPR系統承受能力，其作用效果將會大大降低。

而另一種可能就是在極端環境中生存的古細菌不可能依賴於其他方法進行病毒防禦。細菌阻止病毒侵襲最常見的一種方法就是對外殼蛋白進行突變，而古細菌卻不太可能採取此方法，因為在極端惡劣的生存環境中，外殼蛋白對古生菌的生存顯得至關重要。這也使得CRISPR系統在古生菌中變的更加活躍。

CRISPR/Cas系統的種類分型

因CRISPR/Cas9在基因編輯的簡單性和靈活性，人們往往對其投入了極大的關注和研究力度。但是微生物對該系統並不偏愛。相反，它們傾向於將幾個不同的CRISPR/Cas系統混合起來，並從其他細菌中迅速獲取新的CRISPR/Cas系統及很快淘汰原有的系統。

研究人員已經正式確認了6種不同類型的CRISPR系統，有19種亞型。而Marraffini認為我們僅僅知道其中一小部分的生物功能。然而解開這些系統背後的具體機制是能夠發現CRISPR/Cas系統新的生物功能的關鍵。舉例來說，CRISPR/Cas9是一種II型系統，可採用間隔區序列轉錄的RNA分子對入侵的病毒或質粒DNA直接進行酶切。但是去年從VI系統發現的Cas酶可以切割RNA而非DNA。其中，IV型系統含有一些CRISPR/Cas相關的基因，但缺乏重複序列和間隔序列。

III型系統在自然界中是最常見也最難理解的CRISPR/Cas系統。迄今為止的證據表明，它們並不針對入侵的DNA或RNA本身產生應答反應，而是對DNA轉錄成RNA的過程產生干擾。如果這是事實的話，這將產生一個新的技術，擴大了CRISPR/Cas基因組編輯的形式。

參考文獻：Five big mysteries about CRISPR』s origins