實驗室自建分子診斷項目基本要求專家共識

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來源：中華醫學網

實驗室自建方法（laboratory developed tests, LDTs）是指由實驗室內部研發、確認和使用、以診斷為目的的體外診斷方法。僅限於本實驗室內使用，不得在市場銷售，也不得轉移到其他實驗室使用。做好實驗室自建分子檢測項目（laboratory－developed molecular tests, LDMTs），使其既能滿足臨床日益增長的分子診斷需求，又符合我國行政管理規範的要求。

LDMTs的監管要求

1. 實驗室資質以及環境要求

（1）實驗室資質：分子診斷實驗室應通過衛生計生行政部門認可的臨床基因擴增實驗室審核驗收，並在有效期內。

（2）實驗室環境要求：要求達到國家相關臨床基因擴增實驗室要求。

2. 人員要求

（1）開展LDMTs，實驗室應該有相應團隊（應至少包括具有檢驗等相關專業的博士學位並具有相關研究經驗和工作基礎的研究人員1名，臨床相關專業中級以上醫師1名，檢驗相關專業中級以上檢驗技師1名）。

（2）自建分子診斷項目負責人應至少具有副高級以上專業技術職稱、博士學位、並從事分子診斷工作至少3年。

（3）分子診斷實驗室操作人員應經過有資質的培訓機構培訓合格取得上崗證。

（4）簽發分子病理報告的醫師應至少具有中級病理學專業技術職務任職資格，並有從事分子病理工作的經歷。

3. 管理要求

（1）開展LDMTs項目之前，應有相關臨床科室的申請、醫務機構的審批以及醫院倫理委員會的同意。

（2）應通過相關行政管理機構組織的同行專家委員會的評議，或經所在地省、自治區、直轄市人民政府相關行政部門審核同意。

（3）通過初次評議的項目在試運行一年後，宜申請相關行政管理機構組織的同行專家委員會的再評議，通過再次評議的項目，正式運行。

（4）通過再次評議的項目，宜接受每3年一次的複評審，用以監督該項目的運行情況。

（5）停用項目的標準和措施：一旦造成醫療糾紛或進入司法程序，相關單位的LDMTs項目應立即停止使用，並進入緊急審核程序，通過相關行政管理機構組織的同行專家委員會的評議後，項目方可恢複檢驗。

（6）實驗室須建立相應的程序和管理制度。

質量控制的基本要求

（一）應不低於國家標準、行業標準、地方法規要求，如《醫療機構臨床實驗室管理方法》、《CNAS－CL36醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》等。

（二）開展LDMTs項目臨床應用檢測之前，應進行性能確認。

（三）實驗室自建分子診斷項目中，涉及的市售試劑耗材的質量保證，應不低於國家標準、行業標準和地方法規要求。

（四）定性檢測項目，每次實驗應設置陰性、弱陽性和/或陽性質控物。如為基因突變、基因多態性或基因型檢測，則應包括最能反映檢測情況的突變或基因型樣品，每批檢測的質控至少應有一種基因突變或基因型，並建議在一定周期內涵蓋所有的基因型。

（五）定量檢測項目，每次實驗應設置高值、中值和低值質控物。

（六）應參加通過認可的能力驗證計劃提供者提供的能力驗證計劃。

（七）在沒有能力驗證提供的情況下，通過與其他實驗室（如已獲認可的實驗室、使用相同檢測方法的實驗室、使用配套系統的實驗室）比對的方式確定檢驗結果的可接受性時，應滿足如下要求：

1. 規定比對實驗室的選擇原則。

2. 樣品數量：至少5份，包括正常和異常水平或不同常見基因突變或基因型；頻率：至少每年2次。

3. 判定標準：至少應有≥80%的結果符合要求。

4. 實驗室使用兩套及以上檢測系統檢測同一項目時，應有比對數據表明其檢測結果的一致性，比對頻次每年至少1次，樣品數量不少於20份，濃度水平應覆蓋測量區間，計算回歸方程，系統誤差應

LDMTs的方法學確認的技術指標

1. 準確性（accuracy）：

準確性的評估可以使用參考物質進行評定，或者與另一種臨床上有連續性並被普遍接受的方法（所謂"金標準"）進行比對。在缺乏金標準的情況下，可以引用參考文獻作為指導。用於確認的標本通常選用與臨床檢測同類的標本。樣品數n≥20，濃度應覆蓋測量區間。定性結果一致性宜大於90%，定量結果一般可接受為不能超過對照方法平均含量的3個標準差或者15%變異度。

2. 精確性（precision）：

因需考慮安排不同的操作者、不同批號的試劑以及不同型號的儀器來進行多次的重複操作，一般建議確認一項分子檢驗方法的精密度大致需要20個工作日。在選擇待測標本用於確認實驗時，一般用高和低2個不同含量標本來進行，並接近檢測限。標本類型、取樣與儲存條件應盡量符合待測的臨床標本。目前尚缺乏統一的國際參考標準來確定臨床診斷實驗室可普遍接受的精密度範圍。對於定性試驗，判斷結果的一致性，一般符合率應該大於90%。對於定量試驗，一般確認實驗可接受的精密度為不能超過已知靶分子平均含量的3個標準差或者15%變異度。FDA建議變異度不能超過20%。CNAS的要求則以能力驗證/室間質評評價界限（靶值±0.4對數值）作為允許總誤差（TEa），重複性精密度

3. 參考範圍（reference range）：

對於大部分檢測項目，正常參考範圍與異常值範圍都是在前期研究中就已經明確，目的是為了給特定患者群體確定正常數值範圍。對於定性試驗，參考範圍可以是陰性、正常、無克隆性增生，或者其他能夠表明檢測結果是否正常的用詞。需要注意的是，某些檢測項目是沒有參考範圍的。如對於HCV陽性樣本的HCV基因分型檢測，就無法在所有HCV已知基因型中選出一個"正常"的基因型。

4. 可報告範圍（reportable range）：

對於定性測試，應包括所有的報告結果（如野生型純合子、突變型雜合子或純合子）。對於定量試驗，實驗室必須明確定量分析中的分析測量範圍（analytic measurement range, AMR）是指待測樣品在未被稀釋、濃縮或其他不屬於常規檢查步驟部分的預處理條件下，一種方法可直接測量待測樣品值的範圍。因為可以稀釋樣品，報告範圍可能大於AMR。

5. 分析靈敏度（analytic sensitivity）：

定性實驗中，分析靈敏性常用"最低檢測限（limit of detection, LoD）"來表達。這種檢測低限指能連續在同一個標本中測到靶核酸的可能性在統計學上概率≥95%。定量實驗中，多用"定量限（limit of quantitation, LoQ）"來表示。與LoD不同，LoQ表示一個能夠檢測出的靶物質在標本中的最高和最低的量。對於某些分子檢測方法來說，LoD與LoQ相同。但由於LoD不需要考慮是否在線性範圍內，所以LoD常常比LoQ還要低。

分析靈敏度的確認方法是通過一系列稀釋已知含量的靶病原體或分子來分析最低檢測限。在同一個實驗條件下並用同一個批號的製劑，重複測定已稀釋至最低濃度的標本，重複測定來自臨床的5個標本，60個結果，CV值小於指定標準視為接受。

6. 分析特異性（analytic specificity）：

評價分子檢測方法的交叉反應性，首先要獲得儘可能多的可能與特定待測靶分子發生交叉反應的分子核酸序列並加以分析。如果在所測的標本中存在某些結構和核酸序列相近的病原體或內源性生物分子，應對這些病原體和生物分子進行驗證評價。干擾物的作用是抑制正常PCR反應，使結果偏低，從而造成假陰性。最常見的驗證方法之一是在驗證實驗的過程中加入一個已知的PCR反應對照。在測定過程中，如果PCR反應對照未發生擴增或擴增產物量低於預期值範圍，即可證實有干擾抑制物在該標本中存在。

7. 臨床驗證（clinical validity）：

臨床驗證是確定某種分子檢測技術檢出核酸分子診斷疾病的能力。臨床驗證的目的是評價這種新的分子檢測技術是否適合於特定的臨床疾病的診斷。臨床敏感性不同於分析敏感性：分析敏感性主要指參考方法檢測結果為陽性的結果中，用實驗方法得到陽性結果的一致性；臨床敏感性主要指結果為真陽性的人群中真正罹患某種疾病或異常的比例，強調實驗結果與臨床診斷的一致性。同樣的，臨床特異性也不同於分析特異性，分析特異性主要指參考方法檢測結果為陰性的結果中，用實驗方法得到陰性結果的一致性。臨床特異性主要指實驗結果為真陰性的人群中真正沒有罹患某種疾病或異常的比例[12]。也強調實驗結果與臨床診斷的一致性。值得注意的是在評價某些罕見的疾病，由於陽性病例的數量有限，實驗室進行臨床敏感性評價存有一定難度，這時可以引用文獻報道的臨床敏感性和特異性作為理論支撐。正常對照容易收集，比較容易實現臨床特異性的評價。

分子診斷項目分析前、中、後質量按相關要求執行，國家有相關規定的按相關規定執行。

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