《自然》盤點基因剪刀五大謎題：它是誰？

它是個非常了不起的工具。我想知道這個系統從頭到尾如何工作。 Francisco Mojica並非第一個看見CRISPR的人，但他可能是第一個為它著迷的人。他還記得1992年當他首次瞥見可能引發一場生物技術革命的這個微生物免疫系統的那一天。他在評估地中海嗜鹽菌的基因測序數據，注意到14個不尋常的DNA序列，每個有30個鹼基。

它們的前後讀數大致相同，每次重複35個鹼基左右。很快，他看到更多的類似現象。Mojica由此踏入該領域，使重複序列研究成為他在西班牙阿利坎特大學集中研究的對象。

這並不是一個受歡迎的決定。他的實驗室連續數年沒有收到資助。在會議上，Mojica會抓住機會逮住他能找到的任何大人物追問他們如何看待這種奇怪的小序列重複。「別太關注重複。」他們總是這樣警告他。「很多有機體中都有很多重複。我們知道它們已經有幾年了，但並不知道它們中的大多數如何工作。」

今天，人們已經了解到更多關於這個團簇的信息，即定期中間短迴文的重複序列，這使它獲得了CRISPR的名字，並幫助CRISPR-Cas微生物免疫系統毀滅入侵細菌。但是儘管生物醫藥領域大多數人已經開始敬畏這一系統的運行機制，尤其是一種叫作CRISPR-Cas9的版本，因為它可被用於編輯基因，Mojica和其他微生物學家仍對該系統的一些基礎問題以及它如何運行感到困惑。它如何演變?如何影響微生物演化?為什麼一些微生物在使用它，而另一些則沒有?它是否在基礎生物學上擁有一些其他仍待了解的優點?

它來自哪裡？

諸如CRISPR-Cas的生物學優勢非常明顯。原核生物(細菌以及鮮有人知道的被稱為古生菌的單細胞生物)面臨基因入侵者的不斷衝擊。病毒數量遠超過原核生物，其數量比可達10：1，並且每過兩天就會殺死世界上一半的細菌。原核生物還會交換DNA的廢棄物：質粒。它們可能是寄生的——通過使宿主的資源逐漸枯竭迫使其自殺，如果宿主在設法驅逐這個「搭便車」的分子。似乎沒有什麼地方是安全的：從土壤到海洋到地球上最不宜居的荒涼地方，基因入侵者無處不在。

原核生物已經進化出大量武器來應對這些威脅。但這些防禦有些遲鈍。每個酶都經過規劃以識別特定的序列，只有當一個微生物獲得爭取的基因複本，它才可能得到保護。CRISPR-Cas更具活力。它能以類似於人類抗體在感染後提供長期免疫的方式適應和記住具體的基因入侵者。「當我們一開始聽到這種假設，我們認為這種方式對於簡單的原核生物可能過於複雜了。」荷蘭瓦赫寧根大學微生物學家John van der Oost說。

Mojica和其他人在看到CRISPR迴文重複之間的空間中的DNA有時和病毒基因組中的序列相匹配時，他們推斷了CRISPR-Cas的功能。從那時起，研究人員開始研製出與CRISPR相關聯的特定蛋白，並在細菌和古生菌接觸特定病毒或質粒之後，將這些間隔的序列添加到基因組中。來自於那些間隔區的RNA會指導其他Cas蛋白吞掉任何與該序列相匹配的入侵DNA或RNA。

它如何工作？

近年來，很多關於Cas蛋白補充間隔區的分子細節已經得到詳細了解，但病毒DNA在化學上近似於宿主DNA。在一個承載著DNA的細胞中，這些蛋白如何知道將哪個DNA添加到CRISPR-Cas記憶中?

這一賭注非常高：如果一個細菌添加了它本身DNA的一個片段，它會因為自動免疫進攻而自殺。立陶宛維爾紐斯大學生化學家Virginijus Siksnys說，「這些酶是一把雙刃劍。」

可能是因為細菌和古生菌種群能夠吸收一定錯誤，美國北卡羅萊納大學微生物學家Rodolphe Barrangou說。如果其他細胞能夠在病毒攻擊之後蓬勃發展，一些細胞的自殺可能並不重要。

實際上，當病毒潛入細菌生態系統時，通常1000萬個細菌中會有一個細菌獲得一個自我防禦的間隔區。這一幾率使得研究是什麼驅動間隔區識別非常困難，同時了解為什麼其他細胞失敗之後另一個細胞會繼續下去也很困難。「當它真正發生的時候，很難捕捉到那些細菌。」紐約洛克菲勒大學微生物學家Luciano Marraffini說。

它還可能做什麼？

一些間隔區的起源是另一個謎題。到目前為止觀測到的低於3%的間隔區與DNA資料庫中任何已知的序列相匹配。

這反映了人們對病毒了解得多麼少。大多數測序工作集中於那些感染者、牲畜或是莊稼。「我們對細菌的敵人知之甚少，特別是瘋狂的古生菌的敵人。」雅典喬治亞大學RNA生物學家Michael Terns說。

還有可能一些間隔區是已經不存在或者變異到不可分辨的病毒的鬼魂。但第三種可能性也是熱門的研究領域。研究人員已經發現了CRISPR-Cas系統不僅是阻止基因入群者的案例。在一些細菌中，CRISPR-Cas成分會控制DNA修復、基因表達和生物膜的形成。它們還能決定一個細菌影響其他細菌的能力：嗜肺軍團菌會導致退伍軍人病症，它們一定擁有Cas蛋白Cas2，從而感染其天然宿主變形蟲。「一個主要的問題是有多少生物在防禦之外。」 馬薩諸塞大學醫學院分子生物學家Erik Sontheimer說，「這是未來幾年若干只『靴子』要落地的領域。」

為什麼只有一些微生物會用它？

無論CRISPR-Cas有什麼其他的功能，很明顯一些微生物使用它的幾率超過另一些。超過90%的古生菌具有基於CRIPSR的免疫，而經過測序的細菌僅有1/3擁有它，Koonin說。並沒有非原核生物，甚至是單細胞生物，被發現存在CRISPR-Cas。

其中一種叫作納古菌的古生菌就像一種寄生蟲一樣，寄生在接近沸水中的另一種古生菌身上，並分發了很多與能量製作相關的基因和常規的細胞管家。然而，在其49萬DNA字母的說明書的小世界中，納古菌在CRIPSR-Cas系統上擁有約30個間隔區。「其一大部分基因組致力於CRISPR。」英國聖安德魯斯大學分子生物學家Malcolm White說，「CRISPR一定非常重要，然而我們並不知道其原因。」

這樣的不同表明有一些關鍵的生態因素支持CRISPR-Cas系統，更重視病毒防禦或其他益處，而非細胞自殺的風險，埃克塞特大學彭林校園微生物學家Edze Westra說。極端環境似乎會支持CRISPR-Cas系統，但Westra強調，類似系統的頻率在更適宜居住的棲息地的細菌中間也會呈現出一定變化。例如鳥類病原體——雞毒支原體在其宿主從雞轉變為野雀時會丟掉其CRISPR-Cas裝備。然而，為什麼該系統在雞身上有用，但在野雀身上無用，誰也說不清楚，Westra說。

存在多少種CRISPR-Cas類型？

研究人員已經正式分辨出6種不同的CRISPR系統，包含19個亞種。「實際上我們只知道它們中一小部分在發揮作用。」Marraffini說。

解開那些機制可能就會找到利用CRISPR-Cas系統的新生物技術。例如，備受科學家喜愛的CRISPR—Cas9屬於II系統，該系統利用轉錄自間隔區序列的RNA分子導向一種酶，切斷入侵病毒或DNA質粒。

系統III是自然界最常見的CRISPR-Cas系統，也是了解最少的系統。到目前為止，證據表明它們不是對DNA或RNA自身作出回應，而是對把DNA轉譯到RNA內部的過程作出回應。其他的系統可能也會突然出現，尤其是研究人員將他們的尋找目標擴展到培養皿之外時，包括了來自環境DNA樣本的基因測序。

對於Mojica來說，探索這種多樣性並回答關於CRISPR系統的基本問題比它們引發的革命更吸引人。「我知道它是個非常了不起的工具。它妙極了。它可以被用於治療疾病。」Mojica說，「但這不是我的事。我想知道這個系統從頭到尾如何工作。」