Science：那些年我們發現的突變，有可能是錯的！

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作者：麥子（轉載請註：解螺旋·醫生科研助手）

近期Science上的一篇報告說，有時候你在DNA樣本中發現序列變異好雞凍，但其實有可能並不是真的，而是樣本預處理時造成的損傷。新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs, NEB）的一組研究人員設計了一種演算法來評估這類損傷的程度，然後在公共基因組資料庫如千人基因組（1000 Genomes）和TCGA中測試時，發現問題好像蠻嚴重的0.0

人為造成的變異有多普遍？

眾所周知，從古樣本或福爾馬林固定、石蠟包埋組織中提取的DNA很容易斷裂或受到化學修飾，從而造成生物機體內根本不存在的「突變」。但最近有證據表明，其實任何DNA樣品都有這類人為造成突變的風險。DNA超聲波降解法——用聲波的能量處理DNA片段，以備擴增和測序——已知可能誘導氧化損傷，造成這種「突變」。

NEB的Laurence Ettwiller和同事們開發了一種演算法，稱為全局失衡值（Global Imbalance Value, GIV），正是利用這一現象，即超聲波降解過程中造成的氧化損傷，是把鳥嘌呤轉化成8-羥基鳥嘌呤，而後者在序列讀取過程中會出現類似胸腺嘧啶的表現和行為，造成誤讀。對比兩條互補鏈上讀取的序列，就會發現轉化過的鳥嘌呤無法配對：一條鏈讀出了胸腺嘧啶，互補鏈卻讀出了跟鳥嘌呤配對的胞嘧啶。但自然出現的鳥嘌呤-胸腺嘧啶突變，也會在互補鏈上同時突變成與胸腺嘧啶互補的腺嘌呤。這個演算法就是比較2條鏈的序列讀取數據中胸腺嘧啶的錯配（或失衡）的程度，來計算人為損傷程度。

人為損傷造成的變異和體內自然變異的區別

多數情況下，這類突變都只是在極少的樣品中出現，不會造成太大的問題。但，紐約紀念斯隆凱特琳癌症中心的分子腫瘤學家Marc Ladanyi解釋道：「在癌症生物學研究中，越來越強調檢測亞克隆突變，當然還有血漿游離腫瘤DNA的突變。」兩者在細胞樣品中的比例本來就很小。

Ladanyi並沒有參與這項研究，他說：「當在如此低的等位基因頻率下處理變異時，這種人為造成的突變就不得不考慮了。這篇文章是一個很好的提示，要好好防犯人為因素的影響。」

當研究者把GIV應用於千人基因組（1000 Genomes）和TCGA資料庫時，它檢測到千人基因組資料庫中有41%的數據得到的GIVG-T≥1.5，表明有人為損傷，而TCGA則有73%的序列GIVG-T≥2，提示嚴重損傷。這意味著，那些年我們觀察到的G-T突變，很有可能是錯的。

「這損傷可比我們預期的普遍多了，」本文的共同作者之一，NEB的Thomas Evans說，這類錯誤很可能會擾亂對真實的低頻體細胞突變的識別。

TCGA中GIVG-T分值分布情況

亡羊補牢

雖然數據顯得有些凄涼，但現在好好把GIV利用起來也不晚。Ettwiller說，「人們可以用它來檢查自己的樣本，那些損傷太嚴重的就可以被揪出來了。」 一個樣品的GIV評分也可以用來設定閾值，鑒定潛在的低頻鳥嘌呤變異。——所以現在GIV演算法可作為一個質控步驟，其相關程序已經能在GitHub上免費獲取(https://github.com/Ettwiller/Damage-estimator)，用Perl語言做分析，用R語言作圖。

此外，研究者也提出了建議，即在測序之前先修復一下損傷。在DNA樣品製備過程中加入DNA修復酶，氧化損傷就會有所改善。

不過這還被Ladanyi吐槽：「這篇文章提供了一種技術解決方案，那就是用這類酶混合物製備DNA。但研究者是NEB的，所以還得用NEB的修複試劑盒，所以自然而然就有了利益衝突。」

至於這一點，Ettwiller說，研究組確實使用NEB的酶來修復他們的受損DNA樣品，但他們也沒斷言說這個試盒適用於所有的DNA製備過程。

Evans說，「我們的確賣DNA修複試劑盒，但我們可沒用什麼浮誇的廣告語，這不是我們的畫風。我們還會繼續對它進行評估。」

參考資料：

1.Abundant Sequence Errors in Public Databases

2.L. Chen et al., 「DNA damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification,」 Science, 355: 752-56, 2017.

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