PNAS：日本科學家建立輪狀病毒新型反向遺傳學系統

輪狀病毒是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體之一。但是由於缺乏高效的反向遺傳學系統，使得人們對輪狀病毒複製和致病機制所知有限。近日，來自日本大阪大學的研究人員建立了一個完全基於質粒的輪狀病毒反向遺傳學系統，通過向細胞中轉染多個質粒即可包裝出輪狀病毒，相關研究成果發表在《美國國家科學院院刊》（PNAS）雜誌上

輪狀病毒（Rotavirus，簡稱RV）屬於呼腸孤病毒科，是一種無包膜的雙鏈RNA病毒，基因組包括11段dsRNA片段。全世界每年因輪狀病毒感染導致的嬰幼兒死亡的人數大約為~215，000人，其中大多數發生在發展中國家。RV主要感染小腸上皮細胞，從而造成細胞損傷，引起腹瀉。輪狀病毒每年在夏秋冬季流行，感染途徑為糞-口途徑，臨床表現為急性胃腸炎，呈滲透性腹瀉病，病程一般為7天，發熱持續3天，嘔吐2~3天，腹瀉5天，嚴重出現脫水癥狀。

反向遺傳學是相對於經典遺傳學而言的。經典遺傳學是早期遺傳學家的研究認知路線，由表及裡，即通過雜交等手段觀察表型性狀的變化而推知遺傳基因的存在與變化。隨著分子遺傳學及相關實驗技術的發展，在獲得生物體基因組全部序列的基礎上,通過對靶基因進行必要的加工和修飾，如定點突變、基因插入、缺失、基因置換等，再按組成順序構建含生物體必需元件的修飾基因組，讓其裝配出具有生命活性的個體，研究生物體基因組的結構與功能，以及這些修飾可能對生物體的表型、性狀有何種影響等方面的內容。與之相關的研究技術稱為反向遺傳學技術。

目前建立的RV反向遺傳學系統是部分基於質粒的系統，還需要輔助病毒感染參與，效率有限，科學家們希望能研發出更低成本的，更有效的輪狀病毒反向遺傳學系統。在這一研究中，研究人員通過兩個其他病毒的蛋白：呼腸孤病毒融合相關跨膜小蛋白（fusion-associated small transmembrane）FAST和牛痘病毒加帽酶（cappingenzyme）D1R和D12L，完美的解決了這個問題。研究人員將這兩種蛋白表達質粒與輪狀病毒的11個RNA基因組cDNA拷貝質粒，一起轉染至穩定表達T7 RNA聚合酶的乳倉鼠腎細胞中，由此包裝拯救出了具有感染增殖能力的輪狀病毒。此外，研究人員還突變了輪狀病毒的單個蛋白NSP1，結果表明這可以減少病毒的複製，進一步檢驗了這一系統的有效性。

此研究建立的反向遺傳學系統可以高效修改病毒基因，尋找影響輪狀病毒繁殖和致病性的關鍵決定因子，擴展人們對這種病毒的複製和發病機制的認識，促進高效特異的抗病毒藥物和疫苗的研究。

原文摘要：

Entirely plasmid-based reverse geneticssystem for rotaviruses

Yuta Kanai, Satoshi Komoto, TakahiroKawagishi, Ryotaro Nouda, Naoko Nagasawa, Misa Onishi, Yoshiharu Matsuura, KokiTaniguchi, and Takeshi Kobayashi

Rotaviruses(RVs) are highly important pathogens that cause severe diarrhea among infantsand young children worldwide. The understanding of the molecular mechanismsunderlying RV replication and pathogenesis has been hampered by the lack of anentirely plasmid-based reverse genetics system. In this study, we describe therecovery of recombinant RVs entirely from cloned cDNAs. The strategy requirescoexpression of a small transmembrane protein that accelerates cell-to-cellfusion and vaccinia virus capping enzyme. We used this system to obtaininsights into the process by which RV nonstructural protein NSP1 subverts hostinnate immune responses. By insertion into the NSP1 gene segment, we recoveredrecombinant viruses that encode split-green fluorescent protein–tagged NSP1 andNanoLuc luciferase. This technology will provide opportunities for studying RVbiology and foster development of RV vaccines and therapeutics.

撰文：ipsvirus

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編輯：ipsvirus