4位國內外大牛齊授血液DNA、RNA、蛋白研究秘訣

作者：子非魚（轉載請註：解螺旋·醫生科研助手）

每個細胞都是一座城，城中則擠滿了核酸分子和蛋白質等原住居民。血液作為繞城而行護城河滋養著每座城的同時也積澱著大量的寶藏。小個子外泌體（30-100nm）、大塊頭微囊泡（1000nm）及細胞分泌物（核酸分子）等外來移民們不停地穿梭於護城河之中，並形成一股無形的紐帶連接著每座城。

即是移民，其身上總會烙印著家鄉（原活細胞）的印跡。比如偏愛護犢子的外泌體（exosome），它就將自家娃（蛋白質、RNA、DNA片段）保護的極好，隨便單拎一個娃出來都成為故鄉的最佳代表，而這完全歸功於它對核酸酶、蛋白酶等危險因子不余遺力地掃地出門。它的這種拼盡全力的姿勢，落在腫瘤細胞的眼裡後深得其歡心，雖然它長時間不被人們所重視，卻早已被腫瘤納為在機體中轉移探路的先鋒部隊。

好在亡羊補牢為時不晚，現階段不少研究者正於護城河中挖寶追蹤，並期冀擼清楚外來移民與腫瘤之間千絲萬縷的關係，進而可以早期診斷或監測疾病。無奈，對外來移民的安檢（檢測）方法一直都處於探索階段，很難統一標準化。因而The Scientist雜誌的多位牛人分享了自家隔離外來移民的戰略方針，並貢獻出了相應的注意事項和實驗技巧。

DNA甲基化圖譜分析

研究項目：常言道，愛美之心人皆有之。DNA也不例外，它在表觀遺傳學的「裝飾包裝」之下變得煥然一新，並深刻影響著細胞對基因表達的控制。因而，盧教授則千里追蹤血源性DNA的甲基化圖譜以檢測異常循環DNA的器官來源。

研究成果：盧教授的研究團隊利用全基因組重亞硫酸鹽測序法研究了血漿DNA的甲基化模式，並從十四種不同組織（包括肝臟，血細胞，胎盤等等）的甲基化組中挖掘出5,820個帶有足夠組織信息的甲基化生物標記。隨後他們利用生物信息學重迭解析處理（bioinformatics deconvolution process）方法，以辨別血漿DNA的組成百分比或組織圖。而這幅血漿DNA甲基化模式的「鳥瞰圖」可指出異常循環DNA的組織器官起源。

注意事項：血液中甲基化組會存在個體間的差異變化。另外，測序時重亞硫酸鹽會破壞一些DNA而產生偏好性，因而，單分子測序等更靈敏的方法可有利於血液甲基化研究。

前景展望：盧教授認為分析血液中的組織特異性甲基化模式還會有更多的用途，比如追蹤移植排斥或者鑒定循環腫瘤DNA的來源。其發表於PNAS雜誌的一項研究則通過分析血液中的甲基化DNA，檢測到了癌症患者的肝腫瘤和淋巴瘤，以及孕婦胎盤中的遺傳異常；並為分子診斷與基於器官的傳統醫療之間搭起了一道橋樑。

文獻：Plasma DNA tissue mapping by genome-wide methylation sequencing for noninvasive prenatal, cancer, and transplantation assessments

外泌體蛋白檢測

研究者：加州大學醫學和免疫學教授Edward Goetzl

研究項目：都說「死別」是人生苦，可「生離」又何嘗不讓人肝腸寸斷！阿茨海默症（AD）無情的侵蝕著摯愛親人的生命色彩，並讓他們遺忘了這個世界。因而，Edward Goetzl教授則期望通過追蹤AD患者外泌體的β澱粉樣蛋白和tau蛋白，來實現定期血檢來監控AD患者的疾病歷程。

研究成果：Goetzl的研究團隊收集了AD患者確診前後的血樣，並通過System Biosciences公司的ExoQuick分離血樣中的所有外泌體，再用結合神經元表面蛋白的抗體富集神經元外泌體，檢測這些外泌體所含的蛋白質。研究顯示，在阿爾茨海默症患者的神經元外泌體中，tau、磷酸化tau和β澱粉樣蛋白的表達水平均顯著升高。

注意事項：現在仍不確定血液中神經元外泌體的總量是否會隨著疾病狀態發生改變，因此，處理數據時，應在單個外泌體水平上進行分析。此外，為了避免外泌體中蛋白質降解，提取出外泌體後需要及時進行分析。

前景展望：2013年Goetzl與人合作建立了NanoSomiX公司，希望能開發出阿爾茨海默症血液測試，以提前10-15年鑒定疾病風險，讓高風險人群使用預防性藥物。

文獻：Identification of preclinical Alzheimer s disease by a profile of pathogenic proteins in neurally derived blood exosomes: A case-control study

外泌體microRNA診斷

研究者：Illinois大學副教授Neil Smalheiser

研究項目：自美人miRNA搖曳著身姿住進了外泌體，使其蓬蓽生輝不少，也引得眾多研究者紛至沓來，只為求得與美人結一段緣。而這正是Neil Smalheiser所從事的研究工作，即從血漿外泌體中鑒定出AD患者的miRNA指標

研究成果：Smalheiser研究團隊使用了分離外泌體的傳統方法——差速離心（differential ultracentrifugation）逐漸洗掉游離RNA、蛋白聚合物和細胞殘骸，只留下外泌體。再從外泌體中提取RNA及測序，並建立了成熟miRNA的數據集。隨後即可通過計算模型鑒定了一組可以將阿爾茨海默症和對照準確分開的miRNA。

注意事項：超速離心難以實現高通量，也很難轉化到臨床中去。可利用Thermo Fisher Scientific公司的幾款總外泌體提取試劑盒（Total Exosome Isolation Reagent）分別從細胞培養基、血清、血漿、尿液及其他體液中分離出完整的外泌體。另外，利用Trizol試劑提取RNA時，適量添加糖原可使RNA產量提升了將近23%，對提取低產量RNA是極其有利的。

文獻：Plasma Exosomal miRNAs in Persons with and without Alzheimer Disease: Altered Expression and Prospects for Biomarkers

細胞外RNA診斷

研究者：加州大學聖地亞哥分校副教授Louise Laurent，美國轉化基因組研究所副教授Kendall Van Keuren-Jensen

研究項目：Laurent和Keuren-Jensen作為美國NIH胞外RNA交流協會的成員，正在努力的推動循環miRNA檢測的標準化，提升細胞外RNA研究的可重複性。因而，他們希望鑒定出胎盤功能障礙（Laurent）和大腦損傷（Keuren-Jensen）的循環miRNA指標。

研究成果：由於妊娠期間胎盤會將包含RNA的囊泡釋放到母體血液中，因而Laurent希望從中鑒定出胎盤疾病的miRNA指標，比如子癇前期和宮內生長受限。其初步研究結果顯示，母體血液中的外泌體和微囊泡都可以分離出妊娠特異性miRNA。妊娠後期的miRNA指標與胎盤組織的關係尤為密切。

而Keuren-Jensen研究團隊則將監控撞擊數據的感應器裝在橄欖球運動員的頭盔中，並在橄欖球賽季中收集運動員的血液、尿液和唾液樣本。通過對這些樣本進行RNA測序，尋找與撞擊數據有關的生物學指標。同時，他們發現不同的商業化試劑盒會對細胞外RNA的收集造成很大的差異。

注意事項：從血漿或血清中分離出疾病相關RNA（exRNA）之所以具有一定的挑戰性，一方面是因為exRNA丰度低，另一方面是因為血液中的污染物會抑制PCR。因而，簡化和加速exRNA提取過程的商品化試劑盒便成為了循環exRNA研究不可缺少的工具。

而Van Keuren-Jensen認為利用「接頭」（短片段DNA的粘性末端，可靶向結合擴增的目標分子）的測序試劑盒可能給實驗結果帶來很大的變數。接頭的隨機化，可與某些miRNA結合得更好；但有些接頭二聚體比較少的試劑盒，其測序偏好比較大。因而，建議大家在論文中分享自己所用的試劑盒和分離方法，因為這些信息對實驗結果的重複很有幫助。

另外，Laurent則認為減少樣本批次、盡量由同一個人操作有助於降低結果的差異性。另外，在沒有一個通用標準的情況下，設立內參有助於去除產量或批次差異帶來的許多影響，可提高結果可重複性。

參考文章：Written in Blood

投稿郵箱： tougao@helixlife.com.cn

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