中國學者最新Nature Biotechnology發表Cas9變體單鹼基編輯新成果

來自中科院遺傳與發育生物學研究所等處的研究人員發表了題為「Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9- cytidine deaminase fusion」的文章，利用Cas9變體（nCas9-D10A）融合大鼠胞嘧啶脫氨酶（rAPOBEC1）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI），構成了高效的植物單鹼基編輯系統nCas9-PBE，成功地在三大重要農作物（小麥、水稻和玉米）基因組中實現高效、精確的單鹼基定點突變。

這一研究成果公布在2月27日的Nature Biotechnology雜誌上，文章的通訊作者是遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究員，作為一位植物生物學家，高彩霞研究員曾利用舊技術製造了82種基因的突變，之後其研究組開始採用席捲世界各地生物學實驗室的技術——CRISPR–Cas9來從事基因編輯，曾在六倍體麵包小麥中成功實現了同時編輯3個同源等位基因 ，並由此賦予了小麥對白粉菌的遺傳性抵抗力。去年在Nature雜誌的「Science stars of China」（中國科學之星）一文中詳細介紹了其研究組的工作。文章的第一作者為高彩霞研究組的博士生宗媛和王延鵬。

單核苷酸點突變是作物許多重要農藝性狀發生變異的遺傳基礎。單鹼基的變異會導致氨基酸替換或蛋白質翻譯終止,使基因功能發生改變，從而有可能產生優良的等位基因與優異性狀。傳統誘變及單鹼基突變篩選技術（如TILLING）需要進行基因組規模的篩選，耗時、耗力且鑒定到的點突變數目和種類有限。

基因組編輯技術，特別是基於CRISPR/Cas9系統的基因組編輯技術，可以在基因組靶向位點處產生DNA雙鏈斷裂（DSB），以人為提供的外源供體DNA為模板，通過同源重組（HR）介導的DNA修復途徑來實現對目標基因的單鹼基突變。然而，植物中同源重組效率目前非常低，很難以此實現高效的、穩定的單鹼基突變。因此，植物育種和基因功能研究迫切需要新技術來提高基因組單鹼基定點突變的效率，以實現基因功能與農藝性狀的定向改良。

在最新這篇文章中，研究人員借鑒哺乳動物單鹼基編輯方法，高彩霞研究組利用Cas9變體（nCas9-D10A）融合大鼠胞嘧啶脫氨酶（rAPOBEC1）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI），構成了高效的植物單鹼基編輯系統nCas9-PBE，成功地在三大重要農作物（小麥、水稻和玉米）基因組中實現高效、精確的單鹼基定點突變。

研究人員通過在原生質體中對報告基因BFP以及三種作物中五個內源基因七個位點突變結果的詳細分析, 發現nCas9-PBE可實現對靶位點DNA的C至T替換，C鹼基脫氨化的窗口覆蓋靶序列的7個核苷酸（距離PAM遠端的第 3-9位）；其中單個C的替換效率為0.39-7.07%，多個C的替換效率高達12.48%。

通過進一步的遺傳轉化，研究人員利用該體系獲得了靶標區域單鹼基替換的小麥、水稻和玉米突變植株，突變效率最高可達43.48%。nCas9-PBE技術無需在基因組的靶位點產生DNA雙鏈斷裂（DSB），也無需供體DNA的參與，具有簡單、廣適、高效的特點。nCas9-PBE單鹼基編輯系統成功建立和應用，為高效和大規模創製單鹼基突變體提供了一個可靠方案，為作物遺傳改良和新品種培育提供了重要技術支撐。

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