腸道微生物研究入門必看：神奇菌群有哪些？

人體寄生的微生物數量達數萬億，在人的免疫、消化及代謝方面起重要作用，甚至參與「腦-腸道」之間的信息交流，因此對正常腸道生理及人的健康很重要。所以，腸道菌群的變化或不穩定以及生物多樣性的改變是一系列腸道功能紊亂及代謝疾病的特徵。從健康和社會角度出發，了解宿主-微生物群的複雜關係以及調節方法具有重要意義。

過去對微生物的研究主要依賴分離培養，而環境中99%的微生物都是不可培養的，因此限制了我們對微生物的認識。高通量測序技術和生物信息學的進步大大促進了我們對微生物的研究。

在被高通量測序的多年熏陶下，大夥對16S微生物多樣性、宏基因組、宏轉錄組等名詞應該不是很陌生。這些技術是我們了解微生物的組成及功能的重要手段。

今天我們先來聊聊其中最簡單的微生物多樣性。它回答的問題是：樣本里含有哪些物種，各個物種的比例有多少。

這裡有一個核心的概念，OTU（operational taxonomic unit）：即操作分類單元，是人為將序列按照一定的相似度（細菌通常為97%）劃歸為一組，簡單理解，一個OTU表示一個物種。

OTU的聚類方法有三種：

1、de novo OTU 聚類，是將所有序列直接按照兩兩之間的相似度，劃分成一個個OTU，選取該OTU中丰度最高的序列作為該OTU的代表序列，然後用代表序列比對參考資料庫，獲得該OTU的物種注釋，常用資料庫有RDP、Silva及Greengene，有時也會比對NCBI-nt庫。

優點：不依賴參考資料庫，尤其是所研究的樣品中含有的已知物種較少，如極端環境中。

缺點：受測序錯誤及嵌合體影響較大，說白了就是有些序列並非真實存在，是實驗過程產生的「假序列」，用這種方法聚類時就會被誤認為是一個獨立的OTU，不過可以通過去嵌合體等分析手段緩解。

2、closed-reference聚類，這種方法是將序列與參考資料庫直接比對，比對到同一參考序列的作為一個OTU，在OTU聚類的同時，也獲得了該OTU的物種注釋信息。

優點：所獲得的OTU可信度高；另外，由於不同文章中檢測的16S區域不同，如果要合并分析，不能用de novo OTU picking的方法聚類，因此只能用close-reference方法聚類。

缺點：只能得到已知物種的序列，丟失未知物種的信息。

3 、open-reference OTU聚類，具有上述兩種聚類方法的特點，即將序列與參考序列比對，未比對上的序列再進行de novo聚類。兼具上述兩種方法的優點，但無法用於不同16S區域的合并分析。

由於目前的參考資料庫信息有限，所以OTU的注釋結果中常見到一些uncultured*之類的沒有分類信息。

無論採用哪種聚類方式，最終我們都會得到這樣一種OTU聚類表：

這裡包含每個樣本所含的OTU種類及序列數，同時還有各個OTU的物種注釋信息。需要說明的是，如果某個樣品的測序量比較大，那每個OTU中分到的序列數也會相應增加，因此OTU的序列數不能直接進行樣品間的橫向比較，而是要將序列數轉化為比例，即序列數除以該樣品的總序列數，得到該OTU在該樣品中的比例，用這一比例進行橫向比較，我們就可以說該OTU的丰度在不同樣品間是升高了還是降低了。至此，我們已經知道樣品中的物種及其比例。後續的PCA、heatmap圖以及統計分析等都是基於以上的聚類表。

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