哪些技巧令 PCR 引物設計事半功倍效果？

知識 03-08

臨門一腳，先講核心，掌握核心，引物設計任你馳騁。

引物長度

引物長度對反應特異性、解鏈溫度、退火時間都有較大的影響，最終影響到 PCR 反應是否成功。多數情況下，引物長度約 18~30bp, 引物太短會導致非特異擴增，太長雖然會增加特異性，但是二級結構（如髮夾結構）出現的概率增大。

引物的解鏈溫度

PCR 反應的特異性很大程度上依賴於引物的解鏈溫度（Tm 值）。多數 PCR 反應最優的解鏈溫度應在 55~60℃，如果沒有其他不穩定因素，引物的 Tm 值取決於它的長度、序列組成和濃度，離子強度的影響可以忽略不計，因為不同的 PCR 反應鹽濃度變化不大。

一個反應中所有引物的解鏈溫度應儘可能接近。對於多數 PCR 反應而言，引物之間的差應小於 2~3℃。差值增大，反應效率會降低，甚至直接導致反應失敗。因為 Tm 值髙的引物在低於退火溫度的條件下錯配，而 Tm 值低的引物在髙於退火溫度的條件下與模板只有低濃度結合。

可利用以最近鄰熱力學理論為基礎的公式估算 Tm 值，該理論分析了複式解鏈的熱力學過程。

Tm = [H/S-RIn(c)]-273.15（公式 1）

複式構成物中焓變（H）和熵變（S ）可藉助於最近鄰熱力學參數計算，為摩爾氣體常數，c 為寡核苷酸的物質的量濃度。該分析可確定特定的焓和熵對複式構成物的自由能的影響，該影響由序列中的「最近鄰」造成。最近鄰從 5" 末端起始，焓和熵的效應是加性的。在式（1）中加人另一個條件，以經驗性地計算鹽對複式構成物的穩定性的影響。

Tm =[H/ S + R In(c)] - 273.15 + 12.0lg[Na+]（公式 2）

大多數引物設計軟體都使用 Breslaner 或 SntaLucia 最近鄰參數系統估算寡核苷酸複式構成物的 Tm 值（Breslauer et al. 1986; SantaLucia 1998)。

對於由 20 個或更少個鹼基組成的短序列，可用 Wallace 原理計算其第一位近似值。該公式假定鹽的濃度為 0.9 mol/L，這是斑點雜交分析的常用濃度。

Tm = 2℃ * (A + T) + 4℃ * (G + C)（公式 3）

一般來說，退火溫度比引物解鏈溫度低 5°C。但是，根據這一原則得出的退火溫度常常並不是最優的，必須通過實驗獲得最優溫度。利用梯度熱循環儀很容易實現這一目的。另外，可利用更精確的公式計算乃值（最優退火溫度）（Rychliketal.1990)。

Ta = 0.3 * 引物 Tm 值 + 0.7 * 產物 Tm 值 - 25（公式 4）

複製子的解鏈溫度

除了計算引物的解鏈溫度以外，還要保證產物的解鏈溫度要足夠低，以保證其在 92℃ 時完全解鏈。一般來說，100~600bp 的片段可以有效擴增。該參數有助於使 PCR 效率更高，但並不總是成功的 PCR 所必需的。產物的 Tm 值可根據（式 5）計算。

Tm = 81. 5 + 16. 6*(lg10[K+])+0.41(%G+C) - 675/長度（公式 5）

二級結構

設計引物時，另一個需要考慮的重要因素是二級結構的存在。一個帶有自身同源序列的引物可以回折形成部分雙鏈的髮夾結構。類似地，引物之間的同源可能引起引物二聚體的形成。PCR 反應時，相對於模板而言，引物濃度髙很多，引物之間相互退火要比引物與模板之間退火容易得多。因此，引物如果存在髮夾結構或者二聚體，對於 PCR 擴增往往是致命的，因為這樣會導致非特異的大量背景產物的擴增。避免出現二級結構的最簡單的方法是：選擇 GC 含量約 50%、四種鹼基中缺少一種的引物。

重複

同一鹼基或幾個核苷酸的重複也應盡量避免。不同的重複對 PCR 反應的影響。

GC 夾

在引物的 3"端包含一個 G 或 C 殘基可增加引物擴增效率，這就是所謂的「GC 夾」。它可以促進引物的 3"端正確地結合到模板，因為 GC 夾可以形成更為穩定的氫鍵，因此可以提髙擴增的特異性。以胸腺嘧啶結尾的引物的特異性有降低的趨勢。

高 GC 含量片段的擴增

為了擴增高 GC 含量的 DNA，應該設計 Tm 值（最好為 75~80℃) 較高的引物。髙 GC 含量的 DNA 雙鏈完全解開所需的溫度明顯較一般的 DNA 高。溫度較低時，PCR 複製子的兩條單鏈有較快地重新退火的趨勢，可與引物退火相互競爭。因此，PCR 過程中退火溫度較髙有助於引物退火，因此可以提髙擴增效率。