單細胞測序助跑癌症精準分型

麻省綜合醫院（MGH）、MIT布羅德研究所、哈佛大學近日在Science雜誌上發表了一篇文章（3月31日），使用單細胞RNA測序技術，並結合癌症基因組圖譜分析了星形細胞瘤（astrocytomas）和少突神經膠質瘤（oligodendrogliomas）兩種腦神經膠質瘤（gliomas）的細胞組成。通過細緻全面的基因表達分析，結果顯示兩種腫瘤可能源自同一種神經前體細胞（neural precursors）。可以通過基因突變類型和微環境組成對該兩種腫瘤進行區分。

膠質瘤是指起源於神經膠質細胞的腫瘤。根據美國腦腫瘤註冊中心（CBTRUS）統計，膠質瘤約佔所有中樞神經系統腫瘤的27%，占惡性腫瘤的80%。

腦神經膠質瘤的分類方法有很多種，臨床常用的有兩種：WHO分類系統和Kernoban分級系統。但這兩種分類仍不能準確判斷膠質瘤患者的預後，因此這兩種分類已經不適應目前的臨床治療。雖然基於分子病理基礎的新的膠質瘤分類尚未制定，但是不難想像分子水平的病理分級是膠質瘤的診斷和治療個體化的必要途徑。

MGH病理學系和腫瘤研究中心的Mario Suvà博士說，我們的研究重新定義了兩種關係緊密的神經膠質瘤，過去僅通過IDH（異檸檬酸脫氫酶）基因突變便將它們分別定義為星形細胞瘤和少突膠質細胞瘤。

儘管我們知道這是兩種遺傳類型不同的腫瘤，但我們並不清楚它們內部究竟是否含有相同來源的類似細胞？它們表型的區別是否可以用遺傳學來解釋？究竟是由於它們內部細胞分化不同，還是由於腫瘤外部微環境不同導致了腫瘤分型的不同？

包括「癌症基因組圖譜」在內的幾項研究，已經鑒定了一些控制腫瘤生長的基因突變。這些研究根據腫瘤樣本（包括腫瘤細胞和構成腫瘤微環境的周圍細胞）的基因表達，將腫瘤定義為不同的亞型。

籠統地對腫瘤組織和微環境細胞的進行基因分析被稱為大體測序（bulk phase sequencing），不同細胞的混合測序很可能掩蓋某些關鍵的信息。與之相對的是單細胞測序（single-cell sequencing）。以單一細胞為單位，逐個細胞進行的單細胞RNA測序能夠幫我們更細緻地分類腫瘤。但是單細胞測序的成本較高，因經費限制通常很難被用於腫瘤的個體化分型。

MGH研究團隊設想，採取少量的單細胞測序與大規模研究產生的bulk phase sequencing數據相結合的辦法，或許能揭示出一些腦癌相關的生物學信息。

星形細胞瘤和少突膠質細胞瘤都是不治之症，但是通過手術和放/化療能夠明顯的拓展存活時間。

通常這兩種瘤被認為是由膠質細胞（glial cells）分化出來的兩種亞型，因不同的遺傳學因素、表型因素、以及基因表達差異被劃分為不同的腫瘤類型。但是，兩種腫瘤內部都含有類似的膠質細胞（星形膠質細胞和少突膠質細胞），甚至還攜帶了兩種細胞的分子標誌。讓人不禁懷疑，兩種腫瘤並非分別源自星形細胞和少突膠質細胞，而是直接源自膠質細胞。

研究團隊對10例星形膠質瘤中9800個細胞和6例少突膠質瘤中4300個細胞進行了單細胞RNA測序。再結合癌症基因組圖譜中的165例轉錄組數據，研究人員發現，兩種腫瘤的相同之處是：都含有非增殖性細胞（nonproliferating cells）、類神經幹細胞（resemble neural stem）、祖細胞（progenitor cells）這3種癌症細胞。其中的非增殖細胞被細分為星形膠質細胞樣和少突膠質細胞樣。而不同之處主要是遺傳學差異，以及腫瘤微環境（如特異性免疫細胞丰度等）組成不同。

令人驚奇的是，兩種不同亞型的腫瘤竟然通用相似的幹細胞程序，和相似的神經膠質劃分血統。

共用相似的幹細胞程序驅動生長，提示我們可以使用免疫療法攻擊特定的細胞類型，從而終止腫瘤的生長。

另外研究還發現，即使在更晚期的腫瘤階段，腫瘤細胞的增殖也似乎僅與細胞分型有關。腫瘤組織內的細胞種類越多，越不容易增殖。這意味著，如果可以促進腫瘤細胞分型，將會顯著地控制腫瘤生長。

研究小組表示，下一步研究計劃將使用相同的方法，追蹤其他類型的神經膠質瘤的本源以及調查它們用來增殖分化的程序類型。

Better technology, better work！

當前最常見的單細胞測序應用是在腫瘤研究上，如腫瘤的發生、進化、增殖。例如這期Science文章向大家推薦的利用RNA-Seq進行細緻的腫瘤細胞內部分型研究。從成本角度來看，目前全轉錄組分析RNA-Seq也可以與基因表達譜晶元一決高下。更低廉的價格，越來越快的解析速度（如安若優達的21天建庫成功率大於98%），再結合Illumina高通量測序平台，進而產出高質量的可靠數據。

對待成千上萬的RNA樣本，建議使用轉錄組晶元技術。以銷量最高的Affymetrix新一代全轉錄組基因表達晶元為例，一張晶元包含了超過600萬條探針，不僅能覆蓋編碼轉錄本的外顯子，還能覆蓋外顯子之間的剪接位點和非編碼轉錄本。支持基因水平、外顯子水平和可變剪切水平等多角度分析。幫助研究人員有效的從樣品隱藏的海量信息中發現有用的生物學研究成果。

說到基因表達譜分析和單細胞測序技術，就不得再誇一下當下最火的三代測序。

相比二代測序，三代的口號是「更快、更准、更便宜」。

簡化的樣品製作工序，減少了操作時間、誤差、以及試劑成本。同一套系統和方法，不僅能夠進行DNA測序，通常還可以直接對RNA樣品進行測序。比如單分子測序系統（Single Molecule Real-Time，SMRT），還能直接識別核苷酸修飾，檢測表觀遺傳學差異。精準的SNP檢測，更長的讀長，如國內部分生物公司（派森諾生物科技公司和天津生物晶元）已經進口的PacBio三代單分子基因測序系統，平均長讀長超過10000bp，明顯減少了後續的基因組拼接和注釋工作量。

生物通：歐陽沐